170004. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükóz-izomerán enzim előállítására
11 170004 12 dűli szénforrás is, de lehet más szénforrással együtt vagy a másik szénforrás elfogyása után adni. Az enzimtermelés fokozása érhető el azzal, hogy a ttáptalajba az enzim nem irreverzibilis gátlószereinek egyikét is beletesszük, ilyenek pl. a szorbit és a xilit. A táptalaj alkatrészeit csapvízben oldva, illetve szuszpendálva együttesen sterilezzük 121 C°-on 20-45 percig, kivéve az érzékeny redukáló cukrokat, ezeket célszerű külön sterilezni. A találmány szerinti törzsek tenyésztését 22—37 C°-on, célszerűen 28-32 C°-on végezzük. Az organizmusok közepesen levegőigényesek, pl. 200-300 fordulat/perc rázatás (2,5 cm kitérés) síkrázógépen megfelelő levegőztetést nyújt lombikban. A növekedés elején a táptalaj pH-ja csökken, a szénforrás kifogyásával újra emelkedik. Az enzim termelése a xilóz asszimilálásakor megy végbe, és a xilóz elfogyása után megáll, az enzimszint ezután már csökken. A tenyészetet a csökkenés beállta előtt kell szüretelni, ez az alkalmazott körülményektől függően általában a beöltás utáni 18. és 48. óra közé esik. A találmány szerinti törzsek döntő mértékben intracelluláris glükóz-izomeráz enzimet termelnek. Az erjesztéses oldattól elválasztott sejtek felhasználása cukorszörpök izomerizációjára sokféleképpen történhet. A sejtek minden további nélkül felhasználhatók izomerizációra önmagukban vagy szárítva. A sejtek enzimtartalma a sejteken belül rögzíthető hőkezeléssel (50-85 C°on 5-60 percig) és/vagy más módon, pl. glutáraldehiddel való kezeléssel. Az ilyen oldhatatlan készítmények többször is felhasználhatók. Szükség szerint a glükóz-izomeráz a sejtekből önmagukban ismert módszerekkel kinyerhető, mint pl. ultrahangos feltárással, üvegporral való eldörzsöléssel, nagyfordulatú kalapácsos aprítóval (turmix), kationos detergensekkel, vagy célszerűen oldószer' jelenlétében autolízissel 20—50 C°-on. Az oldatba vitt enzim ismert módszerekkel, mint pl. frakcionált kicsapással, ioncserélő és egyéb kromatográfiával stb. különböző mértékben tisztítható. A különböző mértékben tisztított glükóz-izomeráz enzim közvetlenül felhasználható cukorszörp izomerizációjára, de megfelelő hordozóra rögzítve vagy szemipermeábilis hártyába vagy stabil gélbe zárva többször is felhasználható. A glükóz fruktózzá történő izomerizációja a fent említett enzimkészítmények valamelyikével 45 C° és 80 C° hőmérsékleti határok között, célszerűen 60-70 C°-on történhet. A glükóz-szirup vagy a keményítő-hidrolizátum 0,5 - 4 M glükózt; emellett 0-10 mM, célszerűen 5 mM Mg++ és 0-2 mM, célszerűen 0,5 mM Co++ ionokat tartalmazhat. Az izomerizáció közben a pH 5,8 — 9 között lehet, célszerűen 6,2 és 8 között. Az izomerizáció közben puffer alkalmazásával vagy más módon, pl. bázis adagolásával lehet a pH-t a kívánt határok között tartani. A glükóz-izomeráz enzim aktivitását egységekben fejezzük ki. Egy egységnyi (E) az az enzimaktivitás, amely az alábbi reakciókeverékben egy óra alatt 70 C°-on egy mg fruktózt állít elő (Takasaki): 0,5 ml 0,2 M foszfátpuffer, pH 7,2 5 0,2 ml 1,0 M D-glükóz 0,1 ml 0,1 M magnézium-szulfát 1,2 ml enzimoldat és desztillált víz. A reakciót 2 ml 7%-os perklórsawal állítjuk le. 10 A termelt fruktóz mennyiségét cisztein-karbazol módszerrel határozzuk meg [J. Biol. Chem. 192, 583 (1951)]. A találmány szerinti eljárásban felhasznált tör-15 zsek különösen magas enzimszinteket érnek el xilóz jelenlétében. A xilóz tisztasága nem kritikus, xilán-tartalmú növényi részek, pl. kukoricacsutka savas hidrolízisével nyert nyers xilóz-szörp megfelelő xilózforrásnak bizonyult. A hidrolízis körül-20 menyei a következők lehetnek: 8 kg kukoricacsutka őrleményt (mely a 2 mm lyuk-átmérőjű szitán átmegy) 50 liter vízben oldott 700 ml tömény kénsawal elkeverünk, a zagyot autoklávban 15 percig 135C°-on gőznyomáson tartjuk, utána 2 óra alatt 25 szobahőmérsékletre hűtjük, a pH-t nátrium-hidroxiddal 5-re állítjuk, az alakos részeket kiszűrjük, majd a xilóz-tartalmú oldatot csökkentett nyomáson végzett desztillációval térfogatának 1/3-ára töményítjük. 30 A találmány szerinti eljárásban felhasznált törzsek további előnye, hogy a táptalajjal szemben nem támasztanak különleges igényt. Nitrogénforrásnak elegendő a növényi eredetű olcsó kukoricalekvár, élesztőkivonat, kazein, pepton vagy ami-35 nosavak nem feltétlenül szükségesek a magas enzimszint eléréséhez. Az is előnye a törzseknek, hogy van közöttük könnyen pl. autolízissel feltárhatók (ezek a S. 40 galbus, a S. gracilis és a S. platensis), és ezáltal a glükóz-izomeráz enzim ezekből egyszerűen izolálható és tisztítható. A nehezen feltárható S. matensis és S. niveus törzsek sejtjeiben az enzim viszont előnyösen rögzíthető akár hőkezeléssel, 45 akár egyéb módszerrel, mint pl. glutáraldehides reakcióval. A Lactobacillus brevis glükóz-izomeráz enzimje 30%-osnál töményebb glükóz-oldatok átalakításakor a glükóz-koncentráció emelésével arányosan csök-50 kenő aktivitást mutat [J. Appl. Chem. Biotechnol. 24, 689 (1973)]. A találmány szerinti törzsek olyan glükóz-izomeráz enzimet termelnek, amelyet a glükóz ennél magasabb koncentrációban sem gátol. 55 A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 1. példa 60 l/a. Streptomyces galbus (MNG 136) törzs burgonya-glükózos ferdeagaron nőtt tenyészetéből készült vizes spóraszuszpenzió egy ml-ével oltottuk a következő összetételű táptalajt, melyből 100-100 65 ml-t adagoltunk 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokba: 6
