170004. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükóz-izomerán enzim előállítására

13 170004 14 búzakorpa kukoricalekvár (50% szárazanyagtartalom) magnézium-szulfát-heptahidrát kobalt-klorid-hexahidrát csapvíz A pH-t nátrium-hidroxiddal 7-re állítottuk sterilezés előtt, sterilezés 121 C°-on 30 percig gőzben. A beoltott lombikokat aerob körülmények között 28 C°-on rázattuk síkrázógépen (2,5 cm kitérés, 300 perc/fordulat) 48 órán át. Ekkor a kinőtt tenyészet 5 ml-ével a következő összetételű táptalajt oltottuk, melyből 100 ml volt egy-egy 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban: 30 mg 40g lg 0,24 g 5 ad 1000 ml Inkubációs idő Fruktóz-tartalom 30 mg 40g lg 0,24 g 5 ad 1000 ml 12 óra 24 óra 36 óra 48 óra 0,47 M 0,67 M 0,75 M 0,80 M kukoricalekvár (50% szárazanyag-tartalom) diammónium-hidrogén-foszfát szorbit 40g 4g 4g glükóz (különs sterilezve 40%-os vizes oldatban) kobalt-klorid-hexahidrát 8g 0,24 g csapvíz ad 1000 ml 10 15 2. példa Mindenben az 1. példa l/a. része szerinti módon jártunk el, azzal a különbséggel, hogy Streptomyces galbus helyett Streptomyces gracilis (MG 137) törzset használtunk. A termelt glükóz-izomeráz enzim aktivitása három lombik átlagában 27 E/ml volt. 20 A pH-t nátrium-hidroxiddal 7,5-re állítottuk, amennyiben ez szükséges volt, sterilezés 121 C°-on 20 percig. A beoltott táptalajokat szintén 28 C°-on síkrázógépen rázatva inkubáltuk, és a glükóz elfogyása után (20. óra) kukoricacsutka kénsavas hidrolizátumából (8-20% xilóz-tartalmú) annyit adtunk lombikonként amennyi egy gramm xilózt tartalmazott. A lombikokat tovább rázattuk, és az inkubáció 40. órájában a növesztést megállítottuk, majd a sejteket a táptalajtól elválasztottuk. Az elválasztott sejteket desztillált vízzel mostuk, és eredeti térfogatra töltöttük fel. Néhány csepp toluol hozzáadása után enzimaktivitást határoztunk meg. A termelt glükóz-izomeráz enzim aktivitása három lombik átlagában 40 E/ml volt. 1/b. A fent leírt módon előállított tenyészet 100 ml-ét megszűrtük. A szűréssel a táptalajtól elválasztott sejteket (8 g nedvesen) 500 ml cukorszirupban szuszpendáltuk fel, melynek összetétele a következő: D-glükóz 1,67 M magnézium-szulfát 2 mM kobalt-klorid 0,5 mM, a pH nátrium-hidroxiddal 6,5-re beállítva. A fenti reakciókeveréket enyhe kevergetés mellett 70C°-on inkubáltuk, 12 óránként mintát vettünk, és a reakciókeverék pH-j át nátrium-hidroxiddal visszaállítottuk 6,5-re. A minták fruktóz-tartalmát azok optikai forgatóképességének változásából határoztuk meg. 3. példa Mindenben az 1. példa l/a. része szerinti módon jártunk el, azzal a különbséggel, hogy Streptomyces galbus helyett Streptomyces matensis (MNG 138) törzset használtunk. A termelt glükóz-25 -izomeráz enzim aktivitása három lombik átlagában 45 E/ml volt. -4. példa 30 Mindenben az 1. példa l/a. része szerinti módon jártunk el, azzal a különbséggel, hogy Streptomyces galbus helyett Streptomyces niveus (MNG 139) törzset használtunk. A. termelt glükóz-izomeráz enzim aktivitása három lombik átlagában 35 37 E/ml volt. 5. példa Mindenben az 1. példa l/a. része szerinti módon 40 jártunk el, azzal a különbséggel, hogy Streptomyces galbus helyett Streptomyces platensis (MNG 140) törzset használtunk. A termelt glükóz-izomeráz enzim aktivitása három lombik általában 32 E/ml volt. 45 Szabadalmi igénypont: Eljárás glükóz-izomeráz enzim előállítására 50 süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között, nitrogén- és szénforrást, ásványi sókat, előnyösen kobalt-kloridot tartalmazó táptalajon aerob körülmények között 22-37 C°-on, azzal jellemezve, hogy termelő törzsként Strepto-55 myces galbus (MNG 136) vagy Streptomyces gracilis (MNG 137) vagy Streptomyces matensis (MNG 138) vagy Streptomyces niveus (MNG 139) vagy Streptomyces platensis (MNG 140) törzset használunk, majd az izomeráz aktivitással rendel-60 kező sugárgomba-tenyészetet önmagában ismert módszerekkel sejtmentes enzimmé alakítjuk. A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 774221 - Zrínyi Nyomda 7