169999. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 7-amino-3-dezacetoxi-cefalosporánsav új acilszármazékainak előállítására
11 169999 Teszt antibiotikum 0-3 óra 12 Átlagos epe szint (%) 3-6 óra 6-24 óra 0-24 óra 7-(3-mezilaminofenil-D-•glicilamino)-3-metil--3-cefém-4-karbonsav Cephalexin 26,6 5,5 15,6 2,0 25,4 4,6 67,6 12,1 2. teszt (védőhatás kísérleti egérfertőzésben) a) Teszt antibiotikum: 7-(3-mezilaminofenil-D-glicilamino)-3-metil-3-cefém-4-karbonsav és Cephalexin. b) Teszt-állat: 10-10 ICR-törzsbe tartozó, 20-25 g súlyú hím-egeret alkalmazunk. Az állatokat felhasználásuk előtt 24 órán át éheztettük. 15 Az előírt közegben szuszpendált meghatározott mennyiségű patogén baktériumot intraperitoneálisan befecskendezzük. Egy órával a befecskendezés után orálisan 7-(3-mezilaminofenil-D-glicilamino)-3-metil-3-cefém-4-karbonsavat (1) vagy Cephalexint (2) adunk be. 2 hét elteltével meghatározzuk a túlélő, illetve elpusztult állatok számát és az Edso értéket probit módszerrel kiszámítjuk. Az eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze: Befecskendezett mikroorganizmus Mikroorganizmus befecskendezett mennyisége (sejtek száma egerenként) Befecskendezéshez használt közeg ED 50 (1) mg/egér (2) Staphyloccocus aureus 226 1,8x10* Bx 1,00 3,40 Escherichia coli 312 4,7 x 103 Mx 0,04 0,10 Klebsiella pneumoniae 401 6,5 x 103 Mx 0,04 0,20 Proteus mirabilis 517 6,8 x 10* M** 0,14 1,28 Bx = agy szív infúziós közeg Mx = 2%-os mucin Mxx = 5%-os mucin. A ' 7-(3-mezilaminof enil-D-glicilamino)-3-metil-3--cefém-4-karbonsav valamennyi fenti teszt-módszer szerinti jobb védőhatást mutat, mint a Cephalexin (szignifikáns különbség: p<0,05). Eljárásunk további részleteit a példákban ismertetjük anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk. 1. példa Az alábbi komponensekből készítünk fermentációs közeget: 45 50 55 Kyokuto porított húsleves (védjegy, gyártó cég: Kyokuto Pharmaceutical Company Ltd. Élesztő extrakt Csapvíz 2súly% 0,3 súly% q.s. 60 20 db Sakaguchi-üvegben (térfogat 500 ml) levő 100-100 ml közeget (pH = 7,0) szokásos módon sterilezünk, majd egy kacsnyi 2 napos ferde Pseu- 65 domonas fragi FERM-P 2703 tenyészettel beoltunk. A mikroorganizmust ebben a közegben 30 C -on 24 órán át rázatógépen fejlődni hagyjuk, majd a sejteket centrifugálással összegyűjtjük. A sejteket 500 ml 0,2 mólos foszfát-pufferrel mossuk (pH 5,6), majd ugyanebben a pufferben szuszpendáljuk (pH 5,6). A szuszpenzióhoz (100 ml) 0,2 mólos foszfát-puffért adunk (pH 5,6), mely 2% 3-mezüaminofenil-D-glicin-metilésztert és 1% 7-amino-3-metil-3-cefém-4-karbonsavat tartalmaz. A reakcióelegyet rázatóberendezésben 37 C on 4 órán át inkubáljuk. A reakcióelegy egy részéhez (100 ml) 100 ml acetont adunk, majd az elegyet keverjük és az oldhatatlan anyagot leszűrjük. A szűrletet vákuumban bepároljuk. A koncentrátumot (35 ml) 2 x 10 ml etilacetáttal mossuk. A vizes fázist elvá-O lasztjuk és 35 C -on vákuumban bepároljuk. A koncentrátumot (15 ml) 10%-os sósavval pH = 3,5 értékre savanyítjuk. Az oldatból a reagálatlan kiindulási 7-amino-3-metil-3-cefém-4-karbonsavat kicsapjuk és leszűrjük. A szűrlet pH-ját 10%-os sósavval 2 értékre állítjuk be, makropórusos nem-ionos adszorpciós gyantával (Diaion HP 20, 25 ml) töltött oszlopon átvisszük, és az oszlopon egymás után 6
