169999. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 7-amino-3-dezacetoxi-cefalosporánsav új acilszármazékainak előállítására
13 169999 14 100 ml vizet, 100 ml 5%-os vizes izopropanolt, 50 ml 6,7%-os vizes izopropanolt, majd 80 ml 10%-os vizes izopropanol-oldatot vezetünk át. A 7 -( 3-mezilaminofenil-D-glicilamino)-3-metil-3-cefém-4-karbonsavat tartalmazó aktív frakciókat (150 ml) összegyűjtjük. Az aktív frakciókat vákuumban 35 C -on bepároljuk és a kristályokat jéghűtéssel, kicsapjuk, szűrjük, vízzel mossuk és szárítjuk. 105 mg kristályos 7-(3-mezUaminofenil-D-glicilamino)-3-metil-3-cefém-4-karbonsavat kapunk. IR abszorpciós spektrum (nujol): 3600, 3500,3350,1750,1700,1600 cm-1. NNR abszorpciós spektrum (oldószer: DC1-D20), 6 (ppm): 2,10 3,20 3,18 3,55 5,08 5,52 5,70 7,53 (3H, szinguiett), (3H, szinguiett), (2H, AB kvadruplett, J = 18 Hz), (1H, dubíett, J = 4,5 Hz), (1H, szinguiett), (1H, dublett, (4H, széles szinguiett). 10 15 20 Kyökuto porított bouillon Élesztő extrakt Csapvíz 500 ml-es Sakaguchi-üvegekben 100-100 ml táptalajt (pH 7,0) szokásos módon sterilezünk, majd az alábbi mikroorganizmusok 2 napos ferde tenyészetéből 1 kacsnyi mennyiséggel inokuláljuk: Pseudomonas fragi FERM-P 2703, Pseudomonas maltophila FERM-P 2704, Pseudomonas melophthora FERM-P 2705 és Xanthomonas citri IFO 3835. A mikroorganizmusokat 30C°-on 40 órán át rázatógépen növekedni hagyjuk, majd a sejteket centrifugálással elválasztjuk. A sejteket 30 ml 0,5 mólos foszfát-puff erben (pH 5,6) szuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz (3 ml) 3 ml 0,2 mólos foszfát-puffért (pH 5,6) adunk, mely 2% 3-mezilaminofenil-D-glicin-metilésztert és 0,4% 7-amino-3--metil-3-cefém-4-karbonsavat tartalmaz. Az elegyet 37 C°-on 2 órán át rázatógépen inkubáljuk. A reakcielegyben a 7-(3-mezilaminofenil-D-glicinamido)-3-metil-3-cefém-4-karbonsav termelést vékonyrétegkromatográfiás úton mutatjuk ki (RF = közel 0,6, hordozó: fluoreszkáló anyagot tartalmazó Eastman kromatogram cellulóz-lemez 6065 sz, előhívó oldószer 3:1 :1 arányú n-butanol/ecetsav/víz elegy, kimutatás: UV abszorpció és biokíseriét Bacillus subtilis PCI 219 törzzsel). A reakcióelegyben termelt 7-(3-mezilaminofenil-D-glicilamino)-3-metil-3-cefém-4-karbonsavat Bacillus subtilis PCI 219 törzs segítségével bio-kísérlettel határozzuk meg. Az eredményeket az alábbi táblázatbari foglaljuk össze: 7-(3-mezilaminofenil-D-glicilamino)--3-metil-3--cefém-4-karbonsav hozama (Mg/ml) Vékonyrétegkromatográfia: Hordozó: Eastman kromatogram cellulóz lemez 6065 sz. (fluoreszkáló anyagot tartalmaz, védjegy, 30 gyártó cég: Eastman Kodak Company). Előhívó oldószer: 3:1:1 arányú n-butanol/ecetsav/víz elegy. Kimutatás: UV abszorpciós és bio-kísérlet Bacillus subtilis 35 Bacillus" subtilis PCI 219 törzzsel. RF érték közel 0,6. 40 2. példa Az alábbi komponensekből fermentációs közeget készítünk: 45 2súly% 0,3 súly% q.s. 50 55 60 65 Mikroorganizmus Pseudomonas fragi FERM-P 2703 Pseudomonas maltophila 25 FERM-P 2704 Pseudomonas melophthora FERM-P 2705 Xahthomonas citri IFO 3835 1000 30 1000 200 3. példa Az alábbi komponensekből fermentációs közeget készítünk: Kyokuto porított bouillon Élesztőextrakt Glükóz Glicerin Csapvíz 2 súly% 0,3 súly% 0,'5 súly% l,5súly% q.s. 500 ml-es Sakaguchi üvegekben 100-100 ml fermentációs közeget (pH 7,0) szokásos módon sterilezünk, majd kacsnyi 2 napos ferde Aerobacter acetosus IFO 3129 tenyészettel inokuláljuk. A mikroorganizmust 30 C°-on 40 órán át rázatógépen növekedni hagyjuk, majd a sejteket centrifugáljuk, 30 ml 0,05 mólos foszfát-puff érrel (pH 5,6) alaposan kimossuk, majd 0,2 mólos foszfát-pufferben (pH 5,6) szuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz (3 ml) 3 ml 0,2 mólos foszfát-puff er oldatot (pH 5,6) adunk, mely 2% 3-mezilaminofenil-D-glicin-metilésztert és 0,4% 7-amino-3-metil-3-cefém-4-karbonsavat tartalmaz. Az elegyet 37C°-on 2 órán át rázatógépen inkubáljuk. A reakcióelegyben a 7<3--mezilaminofenil-D-glicilamino)-3-metil-3-cefém-4--karbonsav termelést vékonyrétegkromatográfiás úton mutatjuk ki (RF közel 0,6, a kromatografálást a 2. példában megadott módon végezzük el). A reakcióelegyben levő 7-(3-mezilaminofenil-D-glicilamino)-3-metil-3-cefém-4-karbonsavat Bacillus subtilis PCI 219 felhasználásával bio-kísérlettel határozzuk meg. Hozam: 30 jug/ml. 7
