169999. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 7-amino-3-dezacetoxi-cefalosporánsav új acilszármazékainak előállítására
7 169999 8 A találmány szerinti eljárásnál a mikroorganizmusokat előnyösen fermentlevük alakjában — melyet önmagában ismert módon a mikroorganizifius tenyésztésével készítünk — vagy az ebből nyert anyag formájában alkalmazhatjuk. A mikroorganizmusok fermentációját általában önmagában ismert módon, előnyösen keverés és levegőztetés közben végezhetjük el. A táptalaj asszimilálható szén- és nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmaz. Szénforrásként előnyösen glükózt, szacharózt, laktózt, glicerint, és keményítőt alkalmazhatunk. Nitrogénforrásként előnyösen húsextraktokat, peptonokat, glutinlisztet, kukoricalisztet, gyapotmaglisztet, szójabablisztet, kukoricalekvárt, élesztőextraktokat, kazeinsavat és aminosavakat, szerves vagy szervetlen nitrogénforrásokat, pl. ammóniumsókat (pl. ammóniumnitrátot, ammóniumfoszfátot stb.) alkalmazhatunk. Kívánt esetben ásványi sókat (pl. kalciumkarbonátot, nátriumvagy káliumfoszfátot, magnézium- és rézsókat) és különböző vitaminokat is alkalmazhatunk. A táptalaj pH-ja, a fermentáció hőmérséklete és időtartama a felhasznált mikroorganizmustól függ. Az előnyös pH általában 6 és 9 közötti érték. A fermentáció hőmérséklete előnyösen mintegy 15-38 C°, különösen 27-33 C°. A fermentációs idő általában 15-72 óra, előnyösen 24-50 óra. Az (I) általános képletű 7-(3-alkilszulfonamidofenil-D-glicilamino)-3-metil-3-cefém-4-karbonsavak előállításához a fermentlevet önmagában vagy a belőle kinyert anyagot alkalmazhatjuk. A „fermentléből nyert anyag" kifejezésen enzimes N-acilező aktivitással rendelkező és az N-acilező aktivitás fokozása céljából önmagában ismert módon nyert bármely készítményt értünk. Az N-acilező aktivitás a sejtekben (intracelluláris) vagy a sejteken kívül (extracelluláris) lehet jelen. Amennyiben az aktivitást a sejtek tartalmazzák, pl. az alábbi készítményeket alkalmazhatjuk fermentléből nyert anyag alakjában: 1) Nyers sejtek, ezeket a fermentléből önmagában ismert módon (pl. szűréssel vagy centrifugálással) választjuk el. 2) Szárított sejtek, a fent említett nyers sejtekből önmagában ismert módon (pl. liofilizálással vagy vákuum-szárítással) készíthetők. 3) Sejtmentes extraktok, a nyers vagy szárított sejtek önmagában ismert módon történő elpusztítása (pl. a sejtek kovakővel, tengeri homokkal stb. történő őrlése vagy a sejtek szuperszonikus hullámokkal való kezelése útján) készíthetők. 4) Enzim oldatok, a fent említett sejtmentes extraktok önmagában ismert módon történő tisztítása vagy részleges tisztítása útján állíthatók elS. Amennyiben az aktivitás főként a sejteken kívül található, pl. az alábbi készítményeket alkalmazhatjuk: 1) Felül elhelyezkedő folyadék vagy szűrlet, ezt a fermentléből önmagában ismert módon nyerjük. 2) Enzim oldatok, melyeket a fent említett felül elhelyezkedő folyadék vagy szűrlet tisztításával vagy részleges tisztításával készíthetünk. 5 A találmány szerinti eljárást oly módon végezhetjük el, hogy a (II) és (III) általános képletű vegyületeket mint szubsztrátumokat a fermentlével vagy az abból nyert anyaggal hozzuk érintkezésbe. A reakciót vízben vagy puffer oldatban végezhetjük 10 el, azaz a fermentlevet vagy abból nyert anyagot vízben vagy pufferoldatban oldjuk vagy szuszpendáljuk és a kiindulási anyagokat hozzáadjuk. A reakcióelegy pH-ja, a szubsztrátum koncentrá-15 ciója, a reakcióidő és a reakció-hőmérséklet elsősorban a tenyészet vagy belőle nyert anyag aktivitásától függ. A reakciót általában 4—9, előnyösen 5-7 pH^értéken, 20^45 C -on, előnyösen 35—42 C -on, 1-50 órán át folytatjuk. 20 A reakcióelegyben a (II) képletű kiindulási anyag koncentrációja előnyösen 0,1-20 mg/ml és a (III) általános képletű kiindulási anyagé előnyösen 0,1-40 mg/ml. A reakcióelegyben képződő cél-vegyületet a ce-25 falosporán-szintéziseknél használatos módszerekkel izolálhatjuk és tisztíthatjuk. Általában az alábbi tisztítási módszereket alkalmazhatjuk: megfelelő oldószerekkel történő tisztítás, vákuumbepárlás, liofilizálás, kristályosítás, átkristályosítás és anionos 30 vagy kationos ioncserélő gyantákkal vagy makropórusos nem-ionos adszorpciós gyantákkal történő kezelés. Általában makropórusos adszorpciós gyantákkal való kezeléssel jó eredményeket kapunk. 35 A leírásban a makropórusos nem-ionos adszorpciós gyantákkal történő tisztítást részletesen ismertetjük. E célra előnyösen az alábbi gyanták alkalmazhatók: 40 Amberlite XAD-1, XAD-2 és XAD-4 (védjegy, gyártó cég: Rohm és Haas Co.), Diaion HP 10, HP 20, HP 30, HP 40 és HP 50 (védjegy, gyártó cég: Mitsubishi Kaséi Co. Ltd.). 45 Amennyiben a fenti tisztítású művelet során a cél-vegyületet tartalmazó reakcióelegyben oldhatatlan anyagok vannak jelen, ezeket szokásos módszerekkel, pl. centrifugálással, szűréssel vagy oldó-50 szeres kicsapással eltávolíthatjuk. Ezután a bizonyos mértékben megtisztított reakcióelegyet szakaszos vagy oszlopos módszerrel makropórusos nem-ionos adszorpciós gyantára felvisszük. A reakcióelegy makropórusos nem-ionos adszorpciós gyan-55 tával történő kezelését előnyösen semleges vagy savas pH-tartományban hajthatjuk végre. A reakcióelegyben levő cél-vegyületet makropórusos adszorpciós gyantán adszorbeálhatjuk. Az adszorbeált anyagot a gyantáról hidrofil oldószer-60 -rendszerrel eluálhátjuk. A cél-vegyület eluálásához hidrofil oldószer-rendszerként előnyösen kis szénatomszámú dialkilketonokat (pl. acetont vagy metil-etil-ketont), kis szénatomszámú alkanolokat (t l. metanolt, etanolt, 65 n-propanolt vagy izopropanolt) vagy a fenti oldó-4
