169972. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hordozóhoz kötött fehérje előállítására

5 169972 6 hatjuk, ha megbizonyosodtunk róla, hogy a fehérje és a kapcsolóvegyület reakciója a hordozóhoz való kötődés előtt végbemegy, Ha a hordozó előállítására szolgáló kiindulási anyagok jelenlétében dolgozunk, akkor ehhez kényelmes módszer pél- 5 dául, hogy a hordozó képzésére szolgáló polimer}zációs reakció iniciátorát csak a fehérje és a kapcsolóvegyület reakciója után adjuk hozzá az oldathoz. 10 A találmány szerinti eljárás ugyanazokkal az előnyökkel jár, mint a korábbi eljárásunk. A használható kapcsolóvegyületek körének kiterjesztése azonban az eljárás felhasználási lehetőségeit is kibővíti. 15 A további előnyök közül mindenek előtt megemlítjük a jobb kitermelést, a hordozón fennmaradó reaktív csoportok kiküszöbölését, amelyek aktivált hordozóhoz való rögzítés esetében nem 20 zárhatók ki, a találmány szerint megkötött fehérje nem kívánt ioncserélő tulajdonságainak és ezzel együtt duzzadásának vagy zsugorodásának a kiküszöbölését, a fehérjének a hordozóhoz heteropoláros kötődésének elkerülését, a nem kívánt adszorp- 25 ciós sajátságok elkerülését úgy a szubsztrátum, mint a reakciótermék tekintetében, valamint a pH-optimum nem kívánatos eltolódásának a kiküszöbölését. A kitermelés javulását különösen magasabb molekulasúlyú fehérjék rögzítése esetében ér- 30 jük el. A kataláz-enzim maximális rögzítése például akrilamid-gélben 10%, de ha a találmány szerinti munkamódszernél például akriloil-kloridot használunk kapcsolóvegyületként, a kitermelés 75%. A találmány szerinti eljárás további különös előnye 35 abban áll, hogy alegységekből álló fehérjék is — amelyek érzékenységük miatt ismert módszerekkel csak nehezen vagy egyáltalában nem köthetők hordozóhoz - jó kitermeléssel és nagy stabilitással rögzíthetők. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy 40 a találmány szerinti rögzített enzimek stabilabbak a nem kötött, oldott formájúaknái. Például a találmány szerint hordozóhoz kötött 480 000 molekulasúlyú ureáz-enzim még 70 C -on is teljesen aktívnak bizonyult, míg ugyanezen a hőmérsékleten 45 rögzítetlen állapotban a legrövidebb időn belül irreverzibilisen inaktiválódik. A találmány szerinti eljárás további alapvető előnye abban rejlik, hogy egyidejűleg különböző 50 enzimek, például glükózoxidáz és kataláz - eltérő reaktivitás és molekulasúly esetében is— statisztikus megoszlásban köthetők hordozóhoz, vagy abba beépíthetők. Ez akkor is sikerül, ha a fehérjék izoelektromos pontja különböző. Különösen he- 55 héz esetekben arra is van lehetőség, hogy a különböző fehérjéket külön-külön reagáltassuk egy vagy több kapcsolóvegyülettel és utána közösen hordozóhoz kötjük őket. A találmány szerinti eljárás természetesen arra is alkalmas, hogy a fehérjéket 60 formázott hordozótesthez, például fóliához, csövekhez, rudakhoz, stb. rögzítsük. A következő példák a találmány további megvilágítására szolgálnak. 65 1. példa 100 mg glükózoxidázt (220 E/rng) pH8,0-nál, 10 C on, nitrogénatmoszférában feloldunk 10 ml IM trietanol-amin-puff erben. Ezután hozzáadunk 0,03 ml akriloil-kloridot 3 ml éterben és az elegyet 30 percig keverjük. Ezután éjszakán át 2 liter 0,01M 8,0 pH-jú trietanol-amin-pufferel szemben dializáljuk, majd a csapadékot lecentrifugáljuk és eldobjuk. Az enzimaktivitás 16 000 E. Az így kapott oldathoz 5-10 C -on hozzáadunk 0,4 ml 5%-os dimetil-amino-propionitrilt és 0,4 ml 5%-os ammónium-peroxi-diszulfátot (enzimaktivitás 14 500 E). Ezután nitrogénatmoszférában hozzáadunk 3g akrilamidot, 0,015 g N,N'.-metilén-bisz-akrilamidot 9 ml vízben. Az azonnal meginduló polimerizácó a massza gélszerű megmerevedéséhez vezet. A kapott terméket 0,4 mm lyukbőségű fémszitán átnyomva szemcsésítjük, majd 2 liter 0,2 M 7,5 pH-jú foszfátpufferrel mossuk. A mosóvízzel leválasztott enzimaktivitás 600 E. A polimerizátumot liofilizálva 3,g szárazanyagot kapunk 1500E enzimaktivitással. Az eljárást megismételjük akriloil-klorid hozzáadása nélkül. 3g polimerizátumot kapunk, melynek összeaktivitása 330 E. 2. példa 300 mg tripszint (1500 E) nitrogénatmoszférában 10 ml 8,0 pH-jú 0,5 M foszfátpufferben oldunk. A kapott oldathoz hozzáadunk 0,1 ml akriloil-kloridot 10 ml éterben és 30 percig keverjük. Ezután hozzáadunk 0,4 ml 5%-os dimetil-amino-propionitrilt és 0,4 ml 5%-os ammónium-peroxi-diszulfátot és 30 percig keverjük. Végül nitrogénatmoszférában, 5-10 C -on hozzáadunk 3g akrilamidot, 0,015 g N,N'-metilén-bisz-akrilamidot 9 ml vízben és a fenti körülményeket addig tartjuk fenn, amíg gélszerű szilárd massza képződik. Utóbbit 0,4 mm lyukbőségű fémszitán átnyomva szemcsésítjük és 3 liter 7,5 pH-jú 0,2 M foszfátpufferrel mossuk. A mosóvíz aktivitása 23 E. A mosott terméket gyorshűtő fagyasztással szárítjuk. 3g liofilizátumot kapunk, melynek fajlagos aktivitása 12,9 E/g. Az eljárást hasonló körülmények között megismételjük akriloil-klorid hozzáadása nélkül, ekkor a liofilizátom fajlagos aktivitása 0,5 E/g. 3-12. példa Az 1. példában leírtak szerint kapcsolóvegyületként akrüoil-kloridot, maleinsavazidot, maleinsavanhidridet, allil-bromidot és l-allil-oxi-3-(N-etilén-imin)-prppanol-(2)-t használva glükózoxidáz, tripszin, kimotripszin, urikáz és hexokináz enzimeket rögzítünk. Az eljárást kapcsolóvegyület használata nélkül is megismételjük. A következő 1. táblázat mutatja az összehasonlító kísérletek eredményeit. 3