169971. lajstromszámú szabadalom • Eljárás koleszterinoxidáz előállítására mikroorganizmusokból
9 16" 71 10 4. példa 20 literes fermentorban 15 liter táptalajt - amely 0,5 súly% arnmónium-acetát, 0,05 súly% szekunder kálium-foszfát, 0,2 súly% primer ammó- 5 nium-foszfát, 0,02 súly% magnézium-szulfát-heptahidrát, nyomnyi mennyiségű vas-klorid és kálium-klorid folyóvizes oldata — beoltunk 0,5 liter Nocardia erythropolis ATCC 25544 előtenyészettel és erőteljes levegőztetés mellett tenyésztjük (600 liter 10 levegő per óra, keverési fordulatszám 600 fordulat per perc, a keverő lapátátmérője 120 mm). A tenyészet pH-ját 20%-os ecetsav folyamatos hozzáadásával állandó értéken tartjuk, az ecetsav-hozzáadást addig folytatjuk, amíg a biomassza tömény- 15 sége körülbelül 1,5 g/liter lesz, ami 1 :20 hígítású tápfolyadéknál E = 0,250 értékű zavarosságnak felel meg. 20 A fenti koncentráció elérése után sterilezett koleszterin-szuszpenziót adunk hozzá folyamatosan a további tenyésztés alatt, oly módon, hogy 20 órás tenyésztési időn belül összesen 30 g koleszterint viszünk be a fermentorba. A koleszterin- 25 -szuszpenzió 0,1—0,2% élesztőkivonatot tartalmaz. A tenyészet semlegesítésére ecetsav helyett most már hígított sósavat használunk. A tenyésztést befejezve a biomasszát centrifugálással választjuk el a tápoldattól és 2,6 g/liter szárazanyagot kapunk, 30 melynek aktivitása 12 E/g szárazanyag. 5. példa 35 Kétlépcsős folyamatos tenyésztési eljárásnál a két fermentort — melyek közül az első fokozat 15 liter, a második pedig 70 liter munkatérfogatú -úgy kombináljuk, hogy az 1. példában leírt táptalaj 40 4 literének óránkénti átfolyásánál az első fokozatban 0,25-0,30, a másodikban pedig 0,055-0,065 térfogat/óra az átfolyási sebesség. A tenyésztés elkezdésekor a második fokozatot 1,5 liter, az első fokozatot pedig 0,5 liter. Nocardia erythropolis 45 (ATCC 17895) előtenyészettel oltjuk be (egymás után 5 órás eltolódással). A két fokozat 1,0 l/l/perc levegőztetése mellett a 4. példában leírt növekedési kritériumok eléréséig folytatjuk a tenyésztést, miközben az első fokozatot ecetsavval és a másodikat 50 sósavval semlegesítjük. Egyidejűleg a második fokozathoz - a 4. példának megfelelően - folyamatosan koleszterin-ernul- 5 $ ziót adunk (ugyancsak a 4. példában leírt módon) és megindítjuk az óránkénti 4 liter hozzáfolyatást. A pH-t 7-7,5 értéken tartjuk. így óránként 4 liter tápfolyadékot nyerünk ki 7 g/liter szárazanyag-tartalommal, melynek aktivitása 30 E/g száraz- 6 0 anyag. A tápoldatot hűthető tárolótartályban gyűjtjük össze és időről-időre a baktériumtömeget belőle folyamatos működésű centrifugán leválasztjuk. A pH-érték szabályozására az első fokozatban óránként 10 g 100%-os ecetsav szükséges. 65 6. példa 40 ml Nocardia erythropolis ATCC 17895 szuszpenzióhoz (10g szárazsúly -12 E/g aktivitás-) hozzáadunk 40 ml n-butanolt és néhány percig szobahőmérsékleten keverjük. Az elegyet centrifugáljuk és mind a butanolt, mind a maradék vizes fázist leöntjük. A csapadékhoz újra hozzáadunk 40 ml vizet és homogén sejtszuszpenzió előállítása után ismét hozzáadunk 40 ml n-butanolt, néhány percig szobahőmérsékleten keverjük és centrifugáljuk. A csapadékot 40 ml 0,01 M, 7 pH-jú foszfát -pufferben - amely 0,3% nem ionogén felületaktív szert (Triton X 100, Rohm and Haas Co., USA, 2-[2-(p-terc-oktil-fenoxi)-2-nonil-etoxi]-etanol) tartalmaz - szuszpendáljuk és szobahőmérsékleten 30 percig keverjük. Ezután centrifugáljuk és a csapadékot eldobjuk. A kivonat 120 egység koleszterinoxidázt tartalmaz, melynek fajlagos aktivitása 3 E/mg fehérje. (= 40 mg enzim) Ehhez a kivonathoz 0 C -on szilárd ammónium-szulfátot adunk, amíg az ammónium-szulfát koncentrációja 1,3 M lesz. Ezután a szuszpenziót centrifugáljuk, miközben a nyilvánvalóan lipofil. részt tartalmazó csapadék az oldat felszínén gyűlik össze. Az összetapadt csapadékot leszűrjük, feloldjuk 0,01 M 7 pH-jú foszfát-pufferben és utána ugyanezzel a pufferrel szemben 0 C° kimerítően dializáljuk. A dializáit oldatot 0,01 M 7 pH-jú foszfátpufferrel egyensúlyba hozott, dextrán-alapú dietilamino-etanol-cso portokat tartalmazó, szokványminőségű anioncserélőre visszük fel. Ezen az enzim adszorbeálódik. Az oszlopot ugyanezen pufferrel, majd egymás után a fenti felületaktív szer 0,5%, 2% és 5% vizes oldatával mossuk. Eközben nagymennyiségű szennyeződést eluálunk. Ezután egymás után 0,01 M 7 pH-jú foszfátpufferrel, 0,05 M 7 pH-jú foszfátpufferrel, 0,2 M 7 pH-jú foszfátpufferrel, és 0,5 M 7 pH-jú foszfátpufferrel mossuk. Ezután ismét 0,05 M 7 pH-jú foszfátpufferrel mosunk, majd a kívánt enzimet 0,5% felületaktív szert tartalmazó 0,05 M foszfátpufferrel eluáljuk. Az eluátumban a koleszterinoxidáz oszlopon adszorbelált enzimaktivitásának mintegy 80%-a található, 25—30 E/mg fehérje fajlagos aktivitással. 7. példa Megismételjük a 6. példa eljárását, de elhagyjuk a butanol-víz eleggyel történő mosást. így az ammónium-szulfátos kicsapáshoz olyan kivonatot kapunk, amely 120 E koleszterinoxidázt tartalmaz és fajlagos aktivitása 1 E/mg fehérje. 8. példa (összehasonlító kísérlet) Megismételjük a 6. példa eljárását, de az ioncserélő elúcióját 5% felületaktív anyagot tartalmazó vizes oldattal végezzük el. Semmiféle enzimaktivitást nem tudunk eluálni. Az enzim irreverzibilisen 5
