169971. lajstromszámú szabadalom • Eljárás koleszterinoxidáz előállítására mikroorganizmusokból
7 169971 8 szénforrásként acetátot alkalmazunk, amikor koleszterin-szénforrásra térünk át, az ecetsavat ásványi savval helyettesítjük. Ebben a második növekedési stádiumban előnyösen sósavat használunk a pH-érték szabályozására. Különösen célszerűnek bizonyult egy kétfokozatú, azaz két tartályban végrehajtott folyamatos tenyésztés, mivel ilyen módon a biomasszára vonatkoztatva optimális koleszterinoxidáz-aktivitások érhetők el. Ily módon sikerült 30 E/g szárazanyag-aktivitást elérnünk. Ennél a kétlépcsős folyamatos tenyésztési eljárásnál a mikroorganizmusok átlagos tartózkodási idejét a két fokozatban célszerűen úgy állítjuk be, hogy az a második fokozatban 4—8-szorosa az első fokozatának. Ezt egyszerűen úgy valósíthatjuk meg, hogy állandó átfolyási sebesség mellett a második fokozat tartályának térfogata 4-8-szor nagyobb, mint az első fokozat tartályáé. A mindenkori legcélszerűbb tartózkodási idő mégis bizonyos mértékig ingadozik az egyes mikroorganizmusoknál, és speciális mikroorganizmusokhoz célszerű azt előkísérletek útján meghattározni. Általában kedvezőnek bizonyul két sorbakapcsolt tartályt alkalmazni, 0,25-0,30 térfogat/óra átfolyási sebességgel az első, és 0,055-0,065 térfogat/óra átfolyási sebességgel a második tartályban, a koleszterin-emulzió hozzáadása a második tartályban történik. A következő példák a találmány további megvilágítására szolgálnak. 1. példa 2 liter táptalajt - amely 0,5 súly% kazein pepton, 0,05súly% K2 HP0 4 0,2 súly% NH 4 H 2 P0 4 , 0,02 súly% magnéziumszulfát-heptahidrát, nyomnyi mennyiségű vasklorid és kalciumklorid káliumhidroxiddal pH 7,5-re beállított vizes oldata,- rázólombikban beoltjuk 200 ml, Nocardia erythropolis ATCC 25544 tenyészet inokulummal, és mágneses keverővel történő keveréssel erősen levegőztetjük. Az inokulumot a következőképpen állítjuk elő: 4C -os hűtőszekrényben tárolt ferde-agar mikroorganizmus-tenyészetet (standard 1, Merck, No. 7881) 50 ml bouillon-ra (standard 1, Merck, No. 7882) oltunk le, és a folyékony tenyészetet rázókészülékben inkubáljuk, 10 és 24 óra között időtartamban, ami a tenyészet növekedésétől függ. Az inkubálást az optikai sűrűség mérésével követjük, és addig folytatjuk, míg az oldatból kivett minta 1 :20 arányú hígításban 0,400 értéket ér el (400-600 mju hullámhossztartományban). Ezután ezt a tenyészetet használjuk egy 200 ml-es, ugyanilyen táptalajt tartalmazó lombik beoltására, mikoris a beoltást 20 ml tenyészettel végezzük, és az inkubálást ismét a 0,400 értékű optikai sűrűség eléréséig folytatjuk. A logaritmikus növekedési szakasz megindulásakor - ami a zavarosság fellépésének fokozódásáról ismerhető fel - nedves őrléssel előállított sterilezett vizes koleszterin-szuszpenziót adunk hozzá folyamatosan a további tenyésztés folyamán oly módon, hogy 20 órán belül összesen 10 g koleszterint mérünk be a lombikba. A koleszterin nedves őrlése azért előnyös, mert az indukáló hatás finoman eloszlatott formában lényegesen jobb. 5 Az utolsó hozzáadás után 5 órával a sejtmasszát centrifugálással elválasztjuk, és így 4g baktérium-szárazanyagot kapunk. Ultrahangos feltárás után 3E/g koleszterinoxidázt nyerünk. 1 E az enzim 10 azon mennyiségé, amely 1 perc alatt ljiM koleszterint oxidál, azaz 1/*M H2 0 2 -t képez. Az enzimaktivitás mérése a következőképpen történik: 15 2,31 ml pH értékű 0,5 mólos foszfátpufferhez, mely 1 mg/100 ml mennyiségnek megfelelő 2,2'-azino -d i-(3-etil-benztiázolin-szulfonát)-ot tartalmaz, 0,05 ml 0,37%-os butanolos koleszterinoldatot, valamint 0,6 ml butanolt, 0,02 ml (5 E-nek meg-20 felelő) peroxidázt (Boelvinges Mannh. gyártmány) adunk és a reakciót a megfelelő 0,02 ml térfogatú baktériumextraktummal indítjuk be. (a baktériumextraktum előállítását lásd a 6. példa 1. bekezdésében). Az extinkcióváltozást percenként mérjük, 25 436 nm hullámhosszon, és a keletkezett H2 0 2 -ot standard görbével történő összehasonlítással állapítjuk meg. A reakció hőmérséklete 37 C . A további példákban az inokulum előállítása és 30 az enzim aktivitás mérése a fentiekben megadottak szerint történik. 2. példa 35 Alkalmas tenyésztőedényben az 1. példában leírt táptalaj 15 literét beoltjuk 0,5 liter jól kifejlett Nocardia erythropolis ATCC 17895 előtenyészettel 0,7 l/l/perc levegőztetés közben. Rögtön kezdetben 40 hozzáadunk 0,05% koleszterint. A logaritmikus növekedés megindulásától kezdve (ennek kritériuma azonos az 1. példában leírttal) a további tenyésztés folyamán hozzáadunk sterilezett koleszterin-szuszpenziót úgyhogy 15 órás tenyésztési idő alatt 45 összesen 50 g koleszterint viszünk be a fermentorba. 40 g baktérium-masszát kapunk, melyből ultrahangos feltárással 7,1 E/g koleszterinoxidázt nyerünk. 3. példa A 2. példában leírtak szerint Nocardia erythropolis ATCC 25544 törzset 60 liter munkatérfogat-55 ban tenyésztünk. 25 óra múlva elkezdünk a tenyésztőedénybe friss táptalajt adagolni és azonos mértékben kiveszünk a benőtt tápoldatból. A hígítás foka (átfolyási sebesség per munkatérfogat) eközben 0,04. Egyidejűleg koleszterin-szuszpenziót ada-60 gólunk be a fermentorba, úgyhogy óránként 3g koleszterint mérünk be. Ilyen módon folyamatos tenyésztéssel 1,2-1,5 g/liter baktérium-szárazanyagot kapunk, ugyanazzal a fajlagos aktivitással, mint amit a 2. példában leírt szakaszos eljárással 65 kapunk. 4
