169832. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hordozó rögzített biológiailag aktív makromolekulás vegyületek előállítására

5 169832 6 csolódása végbemegy, felszívattuk, így elvileg az (AB) kapcsolt terméknek már csak a makromolekulás része marad vissza a molekulaszita felületén. A reakcióoldat térfogatát előnyösen úgy választjuk meg, hogy az a molekulaszita teljes duzzadásához nem elegendő, mivel ekkor biztosítva van, hogy a későbbi polimerizáció kizárólag a molekulaszita belsejében történik. A molekulaszitának a (B) kapcsoló vegyülettel és az egyéb polimerizációképes rendszerrel, valamint adott esetben az oldószerrel (ha ilyet alkalmazunk), történő megfelelő összehangolásával a kívánságnak megfelelően készíthetünk olyan molekulaszitát, melyet a polimerizátum teljesen megtölt, de létesíthetünk olyan molekulaszitát is, melynek a polimerizátum lényegében csak a felületét hatolja át, ekkor a molekulaszitán belül bizonyos pórustérfogatot is biztosítunk. A polimerizációra képes rendszer különösen az (A) biológiailag aktív makromolekulás vegyület kívánt tulajdonságainak, például az enzimaktivitás megőrzésének, a megengedhető polimerizációs körülményeknek — elsősorban a polimerizációs hőmérsékletnek — és a (B) vegyület polimerizációra képes funkcionális csoportjai polimerizációs tulajdonságainak figyelembe vételével választjuk meg. Ha az (A) makromolekulás vegyület egy viszonylag hőálló nukleinsav, úgy egy melegítéskor polikondenzációra képes (B) vegyület, mint a polimerizációs rendszer egyetlen alkotórésze is elegendő. Ha az (A) biológiailag aktív makromolekulás vegyület hőre érzékeny enzim, úgy célszerűen kopolimerizációs körülmények között dolgozunk valamely alkalmas kopolimert, így például akrilamidot alkalmazva, hideg polimerizációs katalizátorok, például peroxidok és adott esetben gyorsítók, valamint térhálósítószerek jelenlétében. Iniciátorokként a polimerkémiában általában szokásos iniciátorokat és katalizátorokat alkalmazhatjuk, amennyiben ezek az (A) biológiailag aktív makromolekulás vegyület aktivitását nem befolyásolják hátrányosan. Iniciátorokként, illetve katalizátorokként az olefmesen telítetlen monomerek vagy komonomerek alkalmazásakor szokásosak, például szervetlen vagy szerves peroxidok, azovegyületek és hasonlók jönnek tekintetbe. Járulékosan reakciógyorsítók, mint például aminők és hasonlók alkalmazhatók. Akrilsavvagy metakrilsavszármazékok komonomerként, illetve a (B) vegyület polimerizációképes csoportjaként való alkalmazás esetében egy peroxi-diszulfátból és aminból álló — így dimetil-amino-propionitril-iniciátor kombináció használata különösen bevált. Térhálósítható monomerek alkalmazása a polimerizálandó rendszerben elvileg nem szükségszerű, mivel a polimerizációval a molekulaszita hálón belül mindig a térhálósított polimer sajátságait kapjuk meg. Ennek ellenére a fizikai tulajdonságok módosítására célszerű lehet, egy térhálósító, azaz egy több, mint egy polimerizációra képes csoportot tartalmazó vegyület, például a felsoroltak egyikének alkalmazása. A találmány lehetővé teszi a különösen érzékeny makromolekuláknak a legkíméletesebb módon való rögzítését oldhatatlan hordozón, az aktivitás maximális megőrzése mellett. A találmány különös előnye abban áll, hogy a rögzítés oldott rendszerben történik, ennek megfelelően az (A) biológiailag aktív makromolekulás vegyületnek a (B) kapcsolóvegyülettel való kapcsolása majdnem kvantitatív a kapcsolódási — vagy az átalakulási reakció során. Ezen túlmenően a találmány teljes mértékben hasznosítja az (A) biológiailag aktív makromolekulás vegyület tiszta felületi rögzítésének előnyeit, mivel ez a polimerizátum felületén, amely molekulaszita felületével azonos, szelektíven dúsul és rög-5 zítődik. Ily módon sikerült elérni, hogy a polimerizátum felületét az (A) biológiailag aktív makromolekulás vegyület molekuláival jóval sűrűbben boríthassuk, mint az eddig ismert rögzítési módszerekkel. Ennek megfelelően a találmány szerinti, hordozón rögzített mak-10 romolekulás vegyületek felületi aktivitása felülmúlja az ismert készítményekét. A következő példák kapcsán közelebbről ismertetjük a találmányt. 15 1. példa Kiindulóanyag Térhálósított dextrán alapú molekulaszita Glükóz-oxidáz (220 egység/mg) 20 Akrilamid N,N'-metilén-bisz-akrilamid Akrilsav-klorid Metilén-klorid Ammónium-peroxi-diszulfát 25 N-dimetilamino-propionitril 100 mg glükóz-oxidázt 5 ml 0,5 mólos trietilaminpufferben, pH = 8,0, oldunk és nitrogénatmoszférában 10 C°-ra hűtünk. Ehhez a reakciókeverékhez 2 ml metilén-kloridban levő 0,03 ml akrilsav-kloridot adunk és 30 30 percig keverjük. Ebben az akrilsav-kloriddal reagáltatott fehérje-oldatban 0,8 g akrilamidot és 0,05 g N,N'-metilén-bisz-akrilamidot oldunk, majd 0,05 ml 5%-os N-dimetil-amino-propionitril-oldattal, valamint 0,05 ml 5%-os ammónium-peroxid-diszulfát-oldattal 35 megindítjuk a polimerizációt. Közvetlenül ennek hozzáadása után 5 g térhálósított dextrán alapú molekulaszitát (Sephadex G—25, közepes) adunk a reakciókeverékhez és nitrogénatmoszférában keverjük. A reakcióoldat térfogatát úgy szabjuk meg, hogy az 40 a molekulaszita teljes duzzadásához ne legyen elegendő és ne képződhessen egységes polimerizációs blokk, hanem a polimerizáció kizárólag a molekulaszitaüregekben történjen. A kapott részecskéket 500 ml desztillált vízben szuszpendáljuk, keverővel erősen feliszapoljuk, 45 lenuccsoljuk és liofilizáljuk. Kitermelés: kb. 5 g (a liofilizátumra vonatkoztatva); specifikus aktivitás 160 egység/g liofilizátum. 50 2. Összehasonlító példa Kiindulóanyag Térhálósított dextrán alapú molekulaszita (Sephadex G—25, közepes) 55 Glükóz-oxidáz (220 egység/mg) Brómcián 5 g Sephadex G—25-t (medium) 75 ml vízben előduzzasztunk és 100 ml 2,5%-os brómcián-oldattal elegyítjük. A pH értékét azonnal 11-re állítjuk be és 6 per-60 cig 2n nátrium-hidroxid-oldat hozzáadásával állandóan ezen az értéken tartjuk. Ezután 0,1 mólos nátrium-hidrogénkarbonát-oldattal mossuk. A brómciánnal aktivált Sephadex-et 10 ml 0,5 mólos trietanolamin-pufferben (pH = 8) oldott 200 mg glükóz-oxidázzal elegyítjük. 65 A reakciókeveréket 18 órán át 4 C°-on állni hagyjuk. 3