169832. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hordozó rögzített biológiailag aktív makromolekulás vegyületek előállítására

169832 Ezután 0,2 mólos, 7,5 pH-jú, foszfát-pufferral mossuk. Az így kapott hordozón kötött enzim specifikus aktivitása 38 egység/g. A fehérjék rögzítési reakciója brómciánaktiválással térhálósított poliszaharidok segítségével a legnagyobb aktivitás-kitermelésű módszernek tekinthető. Az 1. és 2. példa összehasonlítása azt mutatja, hogy az enzimnek — a hordozóra vonatkoztatva — kétszeres menynyiségben történő alkalmazása ellenére az ismert eljárással olyan aktivitású termék állítható elő, amely a találmány szerinti aktivitásnak a 25%-át sem éri el. Az alkalmazott mennyiségű enzimre vonatkoztatva az aktivitás-kitermelés a találmány szerinti megoldásnál nyolcszor nagyobb. 3. példa Kiindulóanyag Térhálósított poliakrilamid alapú molekulaszita Glükóz-oxidáz (220 egység/mg) Akrilamid N,N'-metiIén-bisz-akrilamid Akrilsav-klorid Metilén-klorid Ammónium-peroxi-diszulfát N-dimetilamino-propionitril Az enzim-oldat reagáltatását az 1. példában leírt módon végezzük. Az iniciátor-oldatok hozzáadása után azonnal 5 g molekulaszitát (Biogel P6 50—100 mesh) adunk a reakciókeverékhez és nitrogénatmoszférában keverjük. A molekulaszita duzzadása csak néhány másodperc múlva következik be és így jó összekeverést érünk el. A reakcióoldat térfogatát úgy szabjuk meg, hogy az a molekulaszita teljes duzzadásához ne legyen elegendő és ne képződhessen egységes polimerizációs blokk, hanem a polimerizáció kizárólag a molekulaszita-üregekben menjen végbe. A kapott részecskéket 500 ml desztillált vízben szuszpendáljuk, keveréssel erősen feliszapoljuk és ezután két 0,4 és 0,2 mm lyukbőségű normál szitán frakcionáljuk. A 0,2—0,4 mm nagyságú részecskéket egy 20 mm átmérőjű oszlopba töltjük és 4 liter 0,2 mólos 7,5 pH-jú foszfát-pufferrel eluáljuk. Kitermelés: kb. 5 g (a szárazanyagra vonatkozóan) specifikus aktivitás 160 egység/g (a szárazanyagra vonatkoztatva) 4. példa A poliadenilsav (Poly A) rögzítése Kiindulóanyag Poly A Trietilamin-puffer (0,5 mólos, pH = 8,0) Akriloil-klorid Éter Akrilamid N,N'-bisz-akrilamid Dimetilamino-propionitril (5%-os) Ammónium-peroxi-diszulfát (5%-os) Sephadex G—25, közepes 27,4 g Poly A-t 2 ml trietanolamin-pufferben oldunk 5 és 10 C°-ra hűtünk. Ehhez a reakcióoldathoz nitrogénatmoszférában 1 ml éterben oldott 0,01 ml akriloil-kloridot adunk és 30 percig keverjük. Ezután összekeverjük 0,3 g akrilamiddal és 0,2 g N,N'-metilén-bisz-akrilamiddal, valamint 2 g Sephadex G—25-tel és a 10 szuszpenzió polimerizációját 0,02 ml dimetilaminopropionitrillel és 0,02 ml ammóniumperoxi-diszulfáttal megindítjuk. A kapott szemcsés terméket 8 óra múlva egy oszlopon átvezetjük és 2,5 1 0,5 mólos konyhasóoldattal mossuk. 15 A Sephadexen rögzített Poly A felületi rögzítettségének kimutatására a terméket 0,3 n kálium-hidroxidban szuszpendáljuk és egy éjszakán át 37°-on hidrolizáljuk. A hidrolízis után kapott nukleinsav koncentráció, az alkalmazott Poly A-ra számítva, kb. 10%. 20 Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás hordozón rögzített biológiailag aktív mak-25 romolekulás vegyületek előállítására, egy biológiailag aktív (A) makromolekulás vegyületnek, előnyösen fehérjének vagy nukleinsavnak egy, az (A) vegyületet alkilező vagy acilező csoporttal és ezenkívül polimerizációra képes szén-szén kettőskötéssel rendelkező (B) ve-30 gyülettel való reagáltatásával és a kapott (AB) reakciótermék legalább egy további komonomerrel, előnyösen akrilamiddal és adott esetben polimerizációt elősegítő adalékanyagokkal végzett kopolimerizálásával, azzal jellemezve, hogy a polimerizálandó keverékhez a 35 polimerizáció előtt hozzáadunk egy nem, vagy részben duzzasztott molekulaszita-anyagot, előnyösen térhálósított dextrántvagy poliakrilamidgélt, melynek lyukbősége az (A) vegyületet kizárja, de a komonomer és a (B) vegyület bejutását lehetővé teszi, az elegyet polimerizál-40 juk, a kapott terméket adott esetben tisztítjuk és elkülönítjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy (A) makromolekulás vegyületként egy enzimet, antitestet vagy hormont alkalma-45 zunk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy egy olyan (B) vegyületet alkalmazunk, amely kapcsolóképes funkcionális csoportként savhalogenid-csoportot tartalmaz. 50 4. A 3. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy akrilsav-kloridot alkalmazunk. 5. Az 1—4. igénypont bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy molekulaszitaként térhálósított dextránt, vagy térhálósított poli-55 akrilamidot alkalmazunk. 6. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a nem vagy részben duzzasztott molekulaszitát olyan mennyiségben adagoljuk, hogy azt az (AB) kapcsolási termék poli-60 merizációképes oldata ne duzzassza teljesen. A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 77.4913.66-42 Alföldi Nyomda, Debrecen — Felelős vezető: Benkő István igazgató 4