169799. lajstromszámú szabadalom • Eljárás akuleacin antibiotikumok előállítására
13 196799 14 vizes táptalajt egyenletesen elosztunk és 10 db 500 ml-es Erlenmeyer-lombikba (pH 6,5) visszük, amelyeket 120 C°-on 15 percig sterilizáltunk. Ezeket Aspergillus aculeatus M 4214 FERM—P 2324-törzzsel beoltjuk és 26 C°-on 48 órán át tenyésztjük. A tenyészettel 180 1 azonos mennyiségű sterilizált táptalajt oltunk be 250 1-es tartályban és süllyesztett tenyésztést végzünk 26 C°-on 15 órán át 250 ford/perces rázás és 180 l/perces levegőztetés közben. 60 1 tenyészettel aszeptikus körülmények között beoltunk 1,5% szacharózt, 1,4% dextrint, 2% polipeptont, 0,45% kukoricalekvárt, 0,2% KH2P0 4 -t, 0,1% MgS04 -t és 0,1% habzásgátlót tartalmazó, 6,5 pH-jú 2200 1 táptalajt, 2500 1 befogadóképességű fermentáló tartályban és 26 C°-on 90 órát fermentáljuk 1100 l/perces levegőztetés és 200 ford./perc-es kevergetés közben; így 2000 1 fermentált táptalajt kapunk. A baktérium táptalaj vizsgálata alapján a szűrletben 22 ppm/ml akuleacin és a micéliumban 180 ppm/ml akuleacin van. 2. példa 2000 1, az 1. példa szerint kapott tenyészetet centrifugálunk, így 130 kg nedves micéliumot kapunk. A nedves micéliumhoz 400 1 metanolt adunk, keverés közben 18 órát extraháljuk és centrifugálással 435 1 metanolos oldatot kapunk. A maradék micéliumot ismét 200 1 metanollal extraháljuk, így 18 1 metanolos extraktumot kapunk. A két extraktumot elegyítjük (ez 265 g akuleacint tartalmaz) és a metanolt csökkentett nyomáson lepároljuk; így 50 1 koncentrátumot kapunk. Ehhez 50 1 vizet adunk és háromszor 50 1 n-butanollal extraháljuk. Az n-butanolos rétegeket összegyűjtjük (ez 201 g akuleacint tartalmaz). Ezután a n-butanolos réteget vízzel mossuk, a butanolt kis mennyiségű víz hozzáadásával 22 l-re bepároljuk. Ehhez 550 g aktívszenet adunk, leszűrjük, majd vákuumban bepároljuk, így 5 1 sötétbarna viszkózus koncentrátumot kapunk. A koncentrátumot aktív alumíniumoxid-oszlopra visszük (10 1). Az oszlopot 20 1 etilacetáttal mossuk, ezután etanollal eluáljuk, és 5—5 l-es frakciókat gyűjtünk. Az egyesített 3.—13. sz. aktív frakciókat 100 g aktívszénnel kezeljük. A szén eltávolítása után a szűrletet 500 ml-re bepároljuk (olajos anyag). Ezt az olajos anyagot etilacetátmetanol (10: 1) eleggyel feltöltött kovasavgél-oszlopra (15 1) visszük, és 40 1 ugyanilyen eleggyel eluáljuk, így a zsíros szennyezések eltávoznak. Ezután etilacetátmetanol (5: 1) eleggyel eluálva 2—2 l-es frakciókat gyűjtünk. Az összegyűjtött 3.—15. frakciókat összekeverjük és vákuumban bepároljuk, így 51 g sárgás port kapunk. A port 200 ml metanolban oldjuk és ehhez fokozatosan 111:1 arányú etilacetát-n-hexán elegyet adunk, a kicsapódott akuleacinokat szűréssel összegyűjtjük és vákuumban szárítjuk, így 41 g 68% tisztaságú fehér port kapunk. 3. példa A 2. példa szerinti nyers akuleacinból 1,7 g-ot 5 ml n-butanolban oldunk, az oldatot etilacetát-n-butanol (4: 1) elegy vízzel telített oldatával megtöltött kovasavgél oszlopra visszük. Az oszlopot ugyanezzel az oldószerrel eluáljuk és 10—10 g-os frakciókat szedünk. A frakciókat biológiai vizsgálatnak vetjük alá és vékonyrétegkromatográfiásan vizsgáljuk, így a 33.-35. sz. frakciókat aktívnak találjuk. Vákuumszárítás után 5 629 mg fehér port kapunk. A port további tisztítás céljából 50 ml n-butanolban oldjuk, 3 X 10 ml desztillált vízzel mossuk és vákuumban megszárítjuk. 577 mg tisztított akuleacin—A-t kapunk. 4. példa Az 1. példa szerinti fermentálást háromszor megismételjük, így 5,6 m3 tenyészetet kapunk. Ezt a fermentle-15 vet centrifugái-szeparátorral kezeljük, így 450 g nedves micéliumot kapunk. A micéliumhoz 1,2 ms metanolt adunk, keverés közben 20 órán át extraháljuk majd centrifugáljuk, így 1,3 m3 metanolos extraktumot kapunk. A micéliumot ismét 1 m3 metanollal extrahál-20 juk. Ebből az extraktumból 850 l-t az első extraktummal összekeverünk és vákuumban 150 l-re bepároljuk. Ehhez 150 1 vizet adunk, majd 150 1 n-butanollal extraháljuk. Az elválasztott n-butanolos réteghez 2 kg aktívszenet adunk. Az így színtelenített oldatot azeotrópos 25 desztillációnak vetjük alá, így 6 1 sötétbarna, viszkózus koncentrátumot kapunk. Ehhez 40 1 n-hexánt adunk, a csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, n-hexánnal mossuk. így 847 g akuleacint kapunk, sötétbarna nyers por alakjában. A nyers port 3 1 etilacetáttal mos-30 suk, majd 1 1 metanolban oldjuk, keverés közben 10 1 etilacetátot adunk hozzá és a kivált anyagot centrifugálással elkülönítjük. Etilacetáttal végzett mosás után a port vákuumban megszárítjuk, így 369 g világosbarna nyers akuleacin-port kapunk. 5. példa 123 g, a 4. példa szerint kapott akuleacin-port 200 ml 40 n-butanolban oldunk és etilacetát-n-butanol-víz (10: 2: : 1) eleggyel-töltött kovasavgél oszlopra visszük, majd ugyanezzel az oldószerrel eluáljuk. Minden 1 liternyi frakciót biológiai vizsgálatnak és vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatnak vetünk alá. 45 Az akuleacin—B-t, —C-t és —D-t tartalmazó 4.— 25. sz. frakciókat (I. frakció) az akuleacin—A eluálása után és az akuleacin—E-t, —F-t és —G-t tartalmazó 44.—60. sz. frakciókat (II. frakció) az akuleacin—A eluálása után összegyűjtjük és vákuumban bepároljuk. 50 23,4 g I. frakciót és 5,7 g II. frakciót kapunk por alakjában. A 4. példa szerinti maradék nyers port hasonló módon kezelve 70 g I. frakciót és 17 g II. frakciót kapunk. 6. példa Az 5. példa szerint kapott, 70 g I. frakciót 100 ml izopropanolban oldunk és etilacetát-izopropanol-víz 60 (10: 1: 0,5) eleggyel töltött kovasavgél oszlopra viszszük, majd ugyanezzel az oldószereleggyel eluáljuk. Minden 500 ml-es frakciót vékonyrétegkromatográfiásan megvizsgálunk és a 22.—39. sz. frakciókat összegyűjtjük. Az egyesített frakciókat vákuumban bepárol-65 juk, így 14,5 g tisztított I. frakciót kapunk. 7
