169795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa- vagy béta-típusí kristályos 7-(D-alfa-amino-fenil-acetamido) -3-metil-cef-3-ém -4-karbonsav-monohidrát előállítására

3 169795 4 A 25 388/1972 számú japán, továbbá a 781 552 számú belga szabadalmi leírásokban olyan eljárást közölnek a cefalexinnek a D-fenilglicinből vagy ennek egy észteréből és a 7-amino-3-metil-cef-3-em-4-karbonsavból való előállítására, amelynek során egy mikrobiális enzimkomplexet használnak. A kémiai szintézissel szemben a mikrobiológiai eljárás azzal az előnnyel jár, hogy a reakció szelektívebb és jobb a kitermelés. Ugyanakkor azonban ez utóbbi eljárás során, mivel a reakció elsősorban vizes reakcióelegyben játszódik le, vizes desztillációra van szükség, és a kristályosítást, hogy a cefalexint megfelelő kristályos anyagként kapjuk meg, jól meghatározott reakciókörülmények között kell végeznünk. Többek között például a 3 531 481 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban ismertetnek a kémiai szintézissel előállított cefalexin elkülönítésére egy eljárást, amely szerint a cefalexin savaddíciós sóját, például hidrogénkloridját legalább 58 C° hőmérsékleten egy vizes reakcióelegyben oldjuk, majd a cefalexin lemezalakú kristályainak előállítására egy előnyös bázissal, például ammóniumhidroxiddal reagáltatjuk, így ismert, hogy 58 C° alatti hőmérsékleten elsősorban a dihidrát-származék alaktalan, nem állandó tűkristályai keletkeznek, ha pedig növeljük a hőmérsékletet, bekövetkezik a cefalexin bomlása és sötétbarna színű kristályokat kapunk. Továbbá, az előzőekben említett 18 892/1972 számú japán szabadalmi leírás szerint úgy járnak el, hogy a kémiai szintézissel előállított cefalexin N,N-dimetilformamiddal vagy N,N-dimetilacetamiddal alkotott komplexét egy vizes, 1 és 2 közötti pH-jú elegyben oldják, az oldatot a komplex hasítására 40 C° és 70 C° közötti hőmérsékletre melegítik, majd egy bázissal 4,5 és 5,0 közötti értékre állítják be a pH-ját, amikor az oldatból kiválik a nyers cefalexin-monohidrát ikerionos alakja. így kialakult az a megalapozott gyakorlat, hogy a kémiailag előállított cefalexint oldatából 40 C°-nál magasabb hőmérsékleten kell kikristályosítanunk. Ugyanakkor, ha egy mikrobiális enzimkomplex segítségével előállított cefalexin vizes oldatát akarjuk kikristályosítani, mégpedig a fentiek szerint legalább 40 C° hőmérsékleten, a cefalexin bomlása olyan nagymértékű és a kristályok színeződése olyan nagy, hogy nem kapunk megfelelő monohidrátot. Ebből kiindulva részletes vizsgálatokat végeztünk ezen bomlás és a kristályok elszíneződésének megakadályozására, annak érdekében, hogy kristályos, mégpedig állandó kristályos termékhez jussunk. Ennek eredményeképpen kidolgoztunk egy eljárást, amellyel könnyen előállíthatjuk a monohidrát kristályokat egy szennyezett oldatból. Úgy járunk el, hogy a mikrobiális enzimekkel előállított cefalexin szennyezett vizes oldatát töményítjük, a sűrítményt 25 C° és 35 C° közötti hőmérsékleten tartjuk, pH-ját az izoelektromos pontnak megfelelő értékre állítjuk be, amikor bekövetkezik a cefalexin-dihidrát kristályainak növekedése és elkülönülése. A dihidrát-származékot szárítva megkapjuk a megfelelő monohidrát terméket. A találmány a fentiekben ismertetett megfigyelésen alapszik. A találmány tárgya eljárás a cefalexin antibiotikum kristályos alakban való előállítására. A találmány szerinti eljárás értelmében a kristályos cefalexin előállítására úgy járunk el, hogy a 7-amino-3-metil-cef-3-ém-4-karbonsavnak D-fenilglicinnel vagy a D-fenilglicin egy reakcióképes származékával egy mikrobiális enzimkomplex segítségével kivitelezett reakciója után kapott cefalexin vizes oldatát töményítjük, a sűrítmény pH-ját 5 az izoelektromos pont közelének megfelelő értékre állítjuk be, amikor 25 C° és 35 C° közötti hőmérsékleten kiválnak az oldatból a cefalexin-dihidrát hasáb alakú kristályai, majd ezeket szárítva megkapjuk a monohidrát hasáb alakú kristályait. 10 A találmány szerinti eljárás értelmében mikrobiális enzimekkel előállított cefalexin vizes oldatát használjuk. A mikrobiális enzimkomplex speciálisan az olyan, tenyésztéssel kapott mikroorganizmus-sejteket jelenti, amelyek képesek a cefalexin szintézisére oly módon, 15 hogy katalizálják a 7-amino-3-metil-cef-ém-4-karbonsav és a D-fenilglicin, vagy egy reakcióképes származéka reakcióját. Ezeket a mikroorganizmusokat a 25 388/1972 számú japán szabadalmi leírásban megadott törzsek, név szerint a következő genusokba tartozó törzsek kö-20 zül választjuk ki: Mycoplana, Protaminobacter, Acetobacter, Xanthomonas, Pseudomonas, Aeromonas, Escherichia, Staphylococcus, Arthrobacter, Proteus, Corynebacterium, Flavobacterium, Clostridium, Spirillum és Bacillus. Az enzimkomplex jelenti azokat az 25 anyagokat is, amelyek ezekből a mikroorganizmusokból származnak, és amelyeket a sejteket az enzimaktivitást nem károsító eljárással kezelve kapjuk. A mikroorganizmusok tenyésztését bármilyen levegőztetett, kevert tenyészlében, rázott tenyésztéssel és 30 stacionárius tenyészetben kivitelezhetjük, előnyösen levegőztetett fermentációt végzünk. Ami a táptalaj összetételét, az inkubáció hőmérsékletét, a tenyészlé pH-ját stb. illeti, az előzőekben megadott szabadalmi leírás szerint járunk el. 35 Mivel a tenyésztési idő például olyan tényezőtől függ, mint a használt mikroorganizmus, a tenyésztést előnyösen akkor hagyjuk abba, amikor a cefalexin-szintetizáló aktivitás a legnagyobb, nevezetesen az organizmustól függően a logaritmikus növekedési szakasz második 40 fele és a stacioner növekedési szakasz első fele között. Általában 8 óra és 30 óra közötti időn át folytatjuk a tenyésztést. A mikroorganizmusok sejtjeinek a tenyészléből való elkülönítésére az ismert eljárások szerint járunk el, pél-45 dául centrifugálással, szűréssel stb. hajtjuk ezt végre. Az egyik kiindulási vegyület a reakcióképes D-fenilglicin-származék, amely olyan vegyület, hogy képes reagálni az adott mikrobiális enzimkomplex jelenlétében a 7-amino-3-metil-cef-3-ém-4-karbonsavval és cefalexin 50 keletkezik. Ilyen származék például a D-fenilglicin alkil-, például metil-, etilszármazéka stb.; észter-, mint például tiolészter, mint a tioglikolsav-származéka, to^ vábbá amid-származéka. A cefalexint tartalmazó vizes oldatot azonnal tömé-55 nyíthetjük, majd kristályosíthatjuk, előnyösen azonban úgy járunk el, hogy először valamilyen egyszerű tisztítási eljárással tisztítjuk. így például, mivel a cefalexint tartalmazó vizes oldat, a mikroorganizmusokon kívül, nem reagált D-fenilglicin-észtert, D-fenilglicint, 7-ami-60 no-cefalosporánsavat stb. tartalmaz, először a mikroorganizmus sejtjeit távolítjuk el a reakcióelegyből, a szűrletet vagy a fetülúszót egy adszorbensen, például aktív szénen vagy gyantán kromatografáljuk, a cefalexint pedig egy oldószerrel, például vizes alkohollal 65 eluáljuk. 2