169758. lajstromszámú szabadalom • Eljárás élő szarvasmarha adeno-vírustörzs és az élő vírust tartalmazó vakcina előállítására
169758 901 közleményben foglalt adatokból egyértelműen kitűnik, az ismert szarvasmarha adeno vírustörzsekből még legyengítés után sem állíthatók elő vakcinakészítésre alkalmas anyagok. A találmány szerinti eljárással, hőmérsékletre érzékeny törzs kifejlesztésével azonban 5 elháríthatok mindazok az akadályok, amelyek az élő szarvasmarha adeno vírus-vakcinák alkalmazásának mindeddig útját állták. Elő, hőmérsékletre érzékeny szarvasmarha adeno vírus-vakcinákat mindeddig még nem állítottak elő. 10 Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy ha valamely szarvasmarha adeno vírustörzsből nagymértékben specifikus körülmények között hőmérsékletre érzékeny mutánst képezünk, 39 C° és 40 C° közötti letörési hőmérséklettel rendelkező mutánshoz jutunk, amely kü- 15 lönösen előnyösen alkalmazható vakcinagyártásra. Az új törzs ugyanis genetikailag stabil, immunogén, nem patogén, és érzékeny állatoknak beadva nem vált ki észlelhető mellékhatásokat. A találmány szerint előállított vakcinák további elő- 20 nyös tulajdonsága, hogy kedvezően adhatók be. Ezek a vakcinák ugyanis intranazálisan adagolhatok, így a vakcinákban levő szarvasmarha adeno vírustörzs lokálisan csak az állatok felső légutaiban szaporodik el, anélkül, hogy az állatok szervezetének magasabb hő- 25 mérsékletű részeiben — azaz az állatok belső szerveiben — észrevehető vírus-szaporodás lépne fel. A találmány szerinti eljárásban a vakcinakészítésre alkalmas nem-patogén szarvasmarha adeno vírustörzs állításához kiindulási anyagként az United States De- 30 partment of Agriculture, Agricultural Research Service (Peoria, Illinois, Amerikai Egyesült Államok) intézetben NRRL 5733 számon letétbe helyezett szarvasmarha Adeno 3 vírustörzset használjuk fel. Ezt a törzset továbbiakban WBR 1/7 törzsnek nevezzük. A WBR 1/7 35 törzset a WBR 1 vírustörzs (J. H. Darbyshire és munkatársai: Nature 208, 307—8 [1965]) primer embrionális szarvasmarha vese-sejttenyészeten (PFKB) végzett hatlépéses sorozattenyésztésével alakítottuk ki. A hőmérsékletre érzékeny, 39 C° és 40 C° közötti le- 40 törési hőmérséklettel rendelkező szarvasmarha adeno vírustörzset a találmány szerint úgy alakítjuk ki, hogy a WBR 1/7 törzset (NRRL—5733) szobahőmérsékleten 15 percig 4,6 +0,1 pH-értékre pufferolt vizes salétromossav-oldattal hozzuk érintkezésbe. Pufferolt vizes 45 salétromossav-oldatként salétromossav ecetsav-pufferoldattal készített oldatát használjuk. Ez az oldat salétromossavra nézve 1 normál, míg acetát-ionra nézve 0,25 normál koncentrációjú. A kezdeti, körülbelül 106 tagszámú vírus-populáció 50 tagszáma a mutagen kezelés hatására körülbelül 102-re csökken, és 39 C° és 40 C° közötti letörési hőmérséklettel rendelkező, hőmérsékletre érzékeny törzs alakul ki. Az így kialakított, hőmérsékletre érzékeny törzset ezután a szarvasmarha adeno vírusok növekedésének 55 elősegítésére alkalmas bármilyen ismert szövettenyészetben, például szarvasmarha-eredetű vese-sejttenyészetben végzett legalább egy véghígításos tenyésztési lépéssel különítjük el. Az elkülönítést például úgy végezhetjük, hogy a hőmérsékletre érzékeny törzset primer 60 embrionális szarvasmarha vese-sejttenyészeten (PBFK) legalább egy véghígításos lépésben 30 + 1 C°-on 10—20 napig, előnyösen 14 + 1 napig tenyésztjük. Az elkülönített törzset ezután adott esetben a szarvasmarha adeno vírus növekedésének elősegítésére alkal- 65 mas bármilyen ismert szövettenyészetben, például szarvasmarha-eredetű vese-sejttenyészetben (előnyösen primer embrionális szarvasmarha vese-sejttenyészetben) további sorozattenyésztési lépéseknek vethetjük alá. Megfelelő mennyiségű hőmérsékletre érzékeny vírus kialakítása céljából a hőmérsékletre érzékeny törzset például primer embrionális szarvasmarha vese-sejttenyészeten (PBFK) két vagy három lépésben tenyészthetjük. A találmány szerinti mutagen kezelés egy jól ismert és egyértelműen lezajló kémiai reakción, nevezetesen a vírus dezoxiribonukleinsavainak salétromossav hatására bekövetkező oxidatív dezaminálódásán alapul („Principles of Microbiology and Immunology", Davis és munkatársai, 1969, 244. oldal). A találmány szerinti mutagen kezeléssel végtermékként az „Eunice" törzset kapjuk; ezt a törzset az United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service (Peoria, Illinois, Amerikai Egyesült Államok) intézetben NRRL 5732 számon helyeztük letétbe. A találmány szerinti eljárással kapott, „Eunice" nevű, NRRL 5732 letéti számú, hőmérsékletre érzékeny szarvasmarha adeno-vírustörzs lényegében megtartja a kindulási patogén VBR 1/7 törzs immunogenicitását, e törzs azonban hőmérsékletre érzékeny és nem patogén, így igen előnyösen alkalmazható élő szarvasmarha adeno vírus-vakcinák előállítására. A vakcinákat bármilyen ismert vakcinakészítési és stabilizálási módszerrel előállíthatjuk. A találmány szerint tehát a vakcinakészítés során a fenti módon előállított, „Eunice" nevű NRRL 5732 letéti számú, hőmérsékletre érzékeny, 39 C° és 40 C° közötti letörési hőmérséklettel rendelkező szarvasmarha adeno vírustörzset a szarvasmarha adeno vírus növekedésére alkalmas bármilyen ismert szövettenyészeten, például primer embrionális szarvasmarha vese-sejttenyészeten (PFBK) 37 + 1 C°-ot meg nem haladó hőmérsékleten, előnyösen körülbelül 35 + 1 C°-on megfelelő vírusnövekedéshez elegendő ideig inkubáljuk, és a kapott vírusanyagot összegyűjtjük. A fenti eljárással hőmérsékletre érzékeny, nem-patogén szarvasmarha adeno vírust (NRRL 5732 letéti számú Eunice vírust) tartalmazó vakcinákat kapunk. Ipari célokra, nagymennyiségű vakcina előállításához a vírust természetesen egynél több lépésben is tenyészthetjük. Az egyes tenyésztési lépésekben kapott vírus-anyagot oltóanyagként alkalmazhatjuk a következő tenyésztési lépés beindítására. A fenti módon kapott élő szarvasmarha adeno vírusvakcinákat legalább 104,25 TCID 50 (a sejttenyészetet 50%-ban fertőző dózis), célszerűen legalább 105,25 TCID50 dózisegység formájában helyileg adagoljuk az orrgaratba. Vakcinás felhasználáshoz a vírust előnyösen fagyasztva szárított formában tároljuk, és a vakcinát közvetlenül a felhasználás előtt állítjuk elő úgy, hogy a vírusanyaghoz vizet vagy bármilyen más, az orr kezelésére szánt készítmények (például permetek) előállítására alkalmas gyógyszerészeti hígítószert vagy kompozíciót adunk. A találmány szerinti eljárással több élő szarvasmarha légzőszervi vírust tartalmazó vakcinákat is előállíthatunk. E vakcinák hatóanyagként a fent ismertetett, hőmérsékletre érzékeny szarvasmarha adeno vírustörzsön kívül legalább egy további élő szarvasmarha légzőszervi vírust — például fertőző szarvasmarha rhinotracheitis 2
