169758. lajstromszámú szabadalom • Eljárás élő szarvasmarha adeno-vírustörzs és az élő vírust tartalmazó vakcina előállítására
5 169758 6 vírust és/vagy szarvasmarha parainfluenza 3 vírust — tartalmaznak. A vakcinákat célszerűen intranazális adagolásra alkalmas formában készítjük ki. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. A példákban a „megengedett hőmérséklet" és „meg nem engedett hőmérséklet" megjelölésen a következőket értjük: megengedett hőmérsékletnek nevezzük azt a hőmérséklet-tartományt, amelyen belül mind az alaptörzs, mind pedig az abból kialakított, hőmérsékletre érzékeny törzs szaporodásra képes; és meg nem engedett hőmérsékletnek nevezzük azt a hőmérséklet-tartományt, amelyen belül az alaptörzs még szaporodásra képes, az abból kialakított, hőmérsékletre érzékeny törzs szaporodóképessége azonban legalább ezredrészére csökken. 1. példa WBR l / 7 szarvasmarha Adeno 3 vírustörzset (NRRL 5733) „Eagle-féle minimális fenntartó közeg" (MEM) sejttenyészetben szuszpendálunk. 106> 5 TCID 50 /ml koncentrációjú vírus-szuszpenziót készítünk. 1 ml így kapott vírus-szuszpenzióhoz 0,5 ml 4 mólos vizes nátriumnitrit-oldát 0,5 ml 1 mólos ecetsav-nátriumacetát pufferoldattal készített oldatát adjuk. Az elegy végső pH-értéke 4,6. (A pufferoldat előállítása során 1 térfogatrész desztillált vízzel készített, 30 percig 121 C°on sterilizált jégecet-oldatot (6 g jégecet desztillált vízzel 100 ml-re hígítva) 3 térfogatrész, 30 percig 121 C°-on sterilizált nátriumacetát-oldatíal [13,6 g nátriümacetát 100 ml desztillált vízben oldva] keverünk össze.) Az elegyet 15 percig szobahőmérsékleten tartjuk, majd az elegyhez keverés közben pH =7,5+0,5 érték eléréséig 1 n nátriumhidroxid-öldatot csepegtetünk, és így a reakciót leállítjuk'. A pH-változást fenolvörös indikátorral mutatjuk ki, amelyet a vírus-szuszpenziőhoz adunk. A kapott elegyet azonnal dialízisnek vetjük alá, és 5 órán át +4 ± 1 C°-on foszfátpuffer-sóoldat (összetétele: 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na2HP0 4 , 0,2 g KH2 P0 4 , desztillált víz ad 800 ml) és 100 ml desztillált vízzel készített MgCl2 • 6H2 0 oldat elegyével szemben dializáljuk. Ezután a dialízist 0,1 g kalciumklorid 100 ml desztillált vízzel készített oldatával szemben folytatjuk. A végső oldatot, amelynek pH-ja 7,2 és 7,4 közötti érték, szűréssel sterilizáljuk. Ezt a műveletet a nitrit-aniön eltávolítása érdekében többször megismételjük. A kapott oldat mintáját titráljuk, és a vírusfórrást — 70 C°-on tároljuk. A titrálást kémcső-kísérlettel, végpont-hígításos módszerrel végezzük primer embrionális szarvasmarha vese-szövettenyészeten, meg nem engedett hőmérsékleten (39 ± 1 C°-on). Hígításonként 2 kémcsövet használunk fel. 2 hetes inkubálási idő elteltével a faktort feljegyezzük, és a —70 C°-on tárolt mintát 1 TCID50 /0,2 ml koncentrációra hígítjuk. Ezzel a hígított mintával 28 db, primer embrionális szarvasmarha vese-szövettényészettel töltött kémcsövet oltunk be; minden egyes kémcsőhöz 0,1 ml oltóanyagot használunk fel. A kémcsöveket a megengedett hőmérsékleteri (30 + 1 C^ori) inkübäljük. Váltakozó, 7—17 nap közötti inkubációs idő után 10 beoltott kémcső tartalma a szarvasmarha Adeno 3 vírusra jellemző citopatogén hatást [Australian Vet. J. 46, 5 569 (1970) mutat. Ezeket a kémcsöveket l-től 10-ig terjedő számokkal jelöljük, és —70 C°-on tároljukí E tíz pozitív mintát a megengedett hőmérsékleteri (30 C°-on) és a meg nem engedett hőmérsékleten (39 C— on) párhuzamosan titráljuk. Azokat a rnintákat, áme-10 lyeknek a megengedett, illetve a meg néni engedett hőmérsékleten mért faktora lényegesen eltér -egymástól J határhígítási sorozatban tovább teriyésztjükv A kapott vírust ezután két lépésben primer embrionális szarvasmarha vese-sejttenyészeten (PFBK) sorozat-15 tenyésztésnek vetjük alá. A sorozattenyésztést a következőképpenvégezzük: , . -.'!>" : Vesferdonorként szarvasmarha-embriókat használunk. Az embriók veséit aszeptikus körülrnények között eltávolítjuk. Az aprított veseszövetet foszfátpuffer-sóoldat 20 (összetétele: 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na2HPÖ 4 , 0,2'| KH2 P0 4 , desztillált víz ad 800 ml) és 100 ml desztillált vízzel készített MgCl2 • 6H2 0 oldat keverékével, majd 0,1 g kalciumklorid 100 ml desztillált vízzel készített oldatával mossuk. A Végső oldatot, aihelynék-3 pH\ja 25 7,2 és 7,4 közötti érték, szűréssel Sterilizáljuk, majd* 2,5 g/l koncentrációjú pufferolt nátriütókloridos- tfip^ szin-oldáttal tripszinézzük, és az elegyet 10 percig 37; G.°on folyamatosan keverjük. Ezután a folyadékot elöntőjük, és azonos térfogatú friss trípszih-oldattal helyettesít-30 jük. A tripsziriezést keverés közben a szövet kimerüléséig folytatjuk, miközben a folyadékbari szúszpéndált« sejteket időről időre eltávolítjuk. Végüíaz elegyet' 1000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk, és a sejt üledéket a növesztő táptalajjal (10% vírusmentes borjűsié-f 35 rummal és milliliterenként 100 egység penicillin G-nátriumsóval és 100 meg sztreptomicin-szulfáttal kiegészített Eagle-féle alap-táptalaj) elegyítjük. így körülbelül 200 000 sejt/ml koncentrációjú szuszpenziót kapunk. A kapott sejtszuszpenzió 1—1 ml-es mintáit steril 40 kémcsövekben 4—5 napon át 37 C°-on inkubáljuk. E kezdeti inkubációs idő elteltével a növesztő táptalajt eltávolítjuk, és minden egyes kémcsőbe 1,5 ml Eagleféle alap-táptalajt töltünk, amelyhez adalékként csak 2% agamma-vírusmentes borjúszérumot (a Hyland 45 Travenol Labs., Lós Angeles; Kalifoifnia, Amerikai Egyesült Államok cég terméke) adunk. Tíz kémcsövet 0,2 ml, a fentiekben kapott vírús-szuszpóífzióvál-Öltünk be, és 7—14 napon át 35 C9 -on irikúbáljuE A vírus-növekedést a citopatogén hatással mutatjuk"ki. -Avírus1 50 következő sorozattenyésztési lépését friss primer emb-í rionális szarväsrriarhä vtese-szövettényészétén"(PPBK) végezzük. A következő lépést akkor kezdjük, arriikor: már a sejtek körülbelül 50%-a' mutat citápatogéri rta-^; tást. Ekkor a felső folyadékfázist elkülönítjük, és a so-55 rozattenyésztés következő lépésében 0,2 ml így kapott folyadékot használunk fel oltóanyagként. - - •--«•- A A sorözatteriyésztés toásodik lépésében' kapóit ,'Mső folyadékfázisokat elkülönítjük, egyesítjük,! stabilizáló oldattal (összetétele: 60 g kaziton, 100 g szacharóz, 60 75 ml 1/15 mólos dinátríum-'hidrogénfoszfát oldat, 25 ml 1/15 mólos káliumdihidrogénfoszfát oldat, 20 g mono-' kálium-glutamát, desztillált víz ad 4,2;5 liter ) lV2:tér-. fogatarányban hígítjuk, és1 a kapott elegyet fagyasztva szárítjuk. „Eunice" szarvasmarha Adeno 3 vírustörzset 65 (NRRL 5732) kapunk. -.•• 3'
