169712. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nyers urogastron három komponensre történő frakcionálására
169712 7 8 ezeket a frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. A kapott anyag nátiiunvacetátot és polipeptidet tartalmaz. A fentiek szerint kapott anyagot 2 ml vízben oldjuk és 85X1,5 cm méretű, porózus poliakrilamid gélt tartalmazó - mely gél az 5000-nél nagyobb molekulasúlyú molekulákat nem engedi át, azonban az 5000-nél kisebb molekulasúlyú molekulákat belsejébe beengedi -; Biogel P6, 75-40 mikron részecske nagyságú) 0,05 mólos vizes ammónium-acetát-oldattal egyensúlyba hozott oszlopra visszük fel. Az oszlopot a fenti oldattal 7 ml/óra sebességgel eluáljuk és 66 cseppből álló frakciókat gyűjtünk össze. A biológiailag aktív anyagot a 27-42. számú frakciók tartalmazzák, melyek fagyasztva szárítása után 35 mg, 3—5 jug/kg fajlagos aktivitású anyagot kapunk^ A kapott termék teljes mennyiségét vízben oldjuk (5 mg/ml) és az oldatot 4 ml/óra sebességgel 10X 1 cm méretű, amino-etil-cellulózzal (A—E Cellex) megtöltött, 0,01 mólos 5,5 pH-értékű ammónium-acetátecetsav pufferrel .egyensúlyba hozott oszlopra visszük fel. 10, egyenként 66 cseppből álló frakció összegyűjtése után az oszlopot 0,01-0,3 mól koncentrációgradiensű pufferekkel (minden pufferből 40 ml-t alkalmazunk) eluáljuk. A biológiailag aktív anyagot három fraciócsoport, a 24-29., 30-33., és 34-42. frakció tartalmazza. E frakciócsoportokat külön-külön liofilizáljuk. A 24-29. frakcióból a-urogastront, a 30-33. frakcióból főként 0-urogastronból álló, kb. 1 Mg/kg fajlagos aktivitású anyagot (6 mg) és a 34-42. frakcióból főként 7-urogastronból álló, kb. 1 Mg/kg fajlagos aktivitású anyagot (6 mg) kapunk. ß-urogastron további tisztítása 32X1 cm méretű oszlopot karboxi-metil-cellulózzal megtoltunk (Whatman CM 52) és 0,01 mólos, 5,0 pH-értékű nátrium-acetát-ecetsav pufferrel egyensúlyba hozunk. A fentiek szerint kapott, főként 0-urogastronból álló anyagot vízben oldjuk (2 mg/ml) és az oldatot 5 ml/óra sebességgel az oszlopra felvisszük. Az oszlopot ugyancsak 5 ml/óra sebességgel 5,0 pH-értékű 0,01 mól (130 ml) és 0,5 mól (65 ml) közötti koncentrációgrandiensű nátrium-acetát-ecetsav pufferekkel eluáljuk és 66 cseppből álló frakciókat gyűjtünk össze. A biológiailag aktív anyagot az 50-60. frakciókban levő csúcsban mutatjuk ki. A frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. A kapott anyag teljes mennyiségét 1 ml vízben oldjuk és az oldatot 3 ml/óra sebességgel 100X1 cm méretű, porózus poliakrilamid-gélből — mely gél az 5000-nél nagyobb molekulasúlyú molekulákat nem engedi át, azonban az 5000-nél kisebb molekulasúlyú molekulákat belsejébe beengedi - 0,05 mólos ammónium-acetáttal egyensúlyba hozott oszlopra visszük fel. (Biogel P6; részecske nagyságú 75-40 mikron). Az oszlopot ezzel az oldattal 3 ml/óra sebességgel eluáljuk és 30 cseppből álló frakciókat gyűjtünk össze. A biológiailag aktív anyagot a 28-39. frakcióban mutatjuk ki. Ezeket a frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. 2,4 mg 0-urogastront kapunk, mely az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik: 1. Fajlagos aktivitás: 0,2—0,5 jug/kg. 2. Aminosav-arány, elemzés szerint: Asp 7, Ser 3, Glu 5, Pro 1, Gly 4, Ala 2, Val 3, Cys 6, Met 1, lie 2, Leu 5, Tyr 5, His 2, Lys 2, Trp 2, Arg 3. 3. Izoelektromos pont: pH = 4,5 izoelektromos fókuszbeállítással. 4. Papírkromatográfiásan egyetlen folt, Rf = 0,59, n butanol-ecetsav-piridin és víz 30:6:24:20 arányú 5 elegyében. 5. Papírelektroforézis szerint 2,1 pH-jú ecetsavhangyasav elegyben (20 ml hangyasav, 80 ml ecetsav, vízzel 1 literre feltöltve) egy csóvát ad, melynek frontális mobilitása £— DNIP lizinhez viszonyítva 10 1,75. 6. Papírelektroforézissel 6,5 pH-jú piridin-acetatban (3 ml ecetsav, 10 ml piridin, vízzel 1 literre feltöltve) kis ovális terület, mely enyhén az anód irányában mozog. 15 7. Akrilamid-gélelektroforézissel 0,1 mólos 8,9 pH-értékű trisz-sósav pufferben egyetlen folt, melynek mobilitása bróm-fenolkékhez viszonyítva 0,53. 7-Urogastron további tisztítása A ß-urogastron tisztításánál leírt eljárást a főként 20 7-urogastronból álló anyag felhasználásával azzal a változtatással végezzük el, hogy a karboxi-metil-cellulózon történő kromatografálást 5,0 helyett 4,8 pH-értéken hajtjuk végre és a végterméket a porózus poliakrilamid-gél oszlopról nyert eluátum 30—31. 25 frakciójában mutatjuk ki. Az ily módon kapott 7-urogastron az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik: 1. Fajlagos aktivitás: 0,2-0,5 Mg/kg-2. Aminosav-arány, elemzés szerint: Asp 7, Ser 3, Glu 5, Pro 1, Gly 4, Ala 2, Val 3, Cys 6, Met 1, lie 2, 30 Leu 5, Tyr 5, His 2, Lys 2, Trp 2, Arg 2. 3. Izoelektromos pont: pH = 4,3, izoelektromos fókuszbeállítással. 4. Papírkromatográfiás úton n-butanol-, ecetsav-, piridin víz 30:6:2:20 arányú elegyében egyetlen folt, 35 Rf=0,63. 5. Papírelektroforézis szerint 2,1 pH-értékű ecetsav-hangyasav elegyben (20 ml hangyasav, 80 ml ecetsav, vízzel 1 literre feltöltve) egy csóva, melynek frontális mobilitása C-DNP lizinhez viszonyítva 1,57. 40 6. Papírelektroforézis szerint 6,5 pH-értékű piridin-acetátban (3 ml ecetsav, 100 ml piridin, vízzel 1 literre feltöltve) kis ovális terület, mely enyhén az anód felé halad. 7. Akrilamid-gélelektroforézis szerint 0,1 mólos 45 8,9 pH-értékű trisz-sósav pufferban egyetlen folt, melynek mobilitása bróm-fenol-kékhez viszonyítva 0,65. A kiindulási anyagként felhasznált, 5—10 Mg/kg fajlagos aktivitású urogastron készítményt a követke-50 zőképpen állítjuk elő: Férfi vizeletet, 24 órás időközökben, mindenkor telített oldat képzéséhez elegendő mennyiségű kloroformot tartalmazó edényekben összegyűjtünk. Az összegyűjtött vizeletet gyorsan keverjük, miközben a 55 pH-t jégecettel (kg. 2,2 ml/l liter vizelet) 5-re állítjuk be. A vizelethez literenként 20 ml 25 súly/térfogat%os vizes csersav oldatot (BP.) adunk, majd 1 óra múlva kb. 1 g/liter mennyiségben vízzel mosott kovasavgélt (Celite 545) adunk hozzá. A szuszpenziót 60 keverjük és a kiváló csapadékot egy éjjelen át ülepedni hagyjuk. A felül elhelyezkedő folyadékot leszívatjuk és a maradékot nagy zsugorított üvegszűrőre visszük fel, melybe előzőleg vékony kovasavgél réteget helyeztünk. A csapadékot kevés vízzel, majd 65 metanollal addig mossuk, míg színtelen mosófolyadé-4
