169712. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nyers urogastron három komponensre történő frakcionálására

169712 9 10 kot kapunk. A csapadékot szárítjuk, lombikba visszük át és 1 térfogat% tömény sósavat tartalmazó metanollal péppé keverjük össze. A kapott pépszerű anyagot leszűrjük és a szűrőn a fenti sósavas metanollal addig mossuk, míg színtelen mosófolyadékokat kapunk. Egy liter kiindulási vizeletre számítva összesen 5 ml savas metanolt alkalmazunk. Az egyesített szűrleteket 4 térfogatnyi acetonnal lassan hígítjuk, majd a kiváló csapadékot ülepedni hagyjuk. A felül elhelyezkedő folyadékot dekantáljuk és a csapadékot centrifugálással összegyűjtjük. A maradékot (kb. 20 mg/l liter vizelet) acetonnal kétszer mossuk és vákuumban szárítjuk. Gyengén bázikus ioncserélő gyantát (Deacidite G-IP, 3-5% DVB, 100-200 mesh) acetát formába hozunk, 35X2,8 cm méretű oszlopba töltünk és előbb 2 mólos ecetsavval, majd vízzel mosunk. 20 g kapott terméket vízben oldunk és az oldat pH-ját 5—6-ra állítjuk be, majd 2 literre hígítjuk, és a gyantán 80 ml/óra sebességgel átszűrjük. Az oszlopot vízzel addig mossuk míg átlátszó eluátumokat kapunk, majd 400 ml 50 térfogat%-os vizes ecetsavval eluáljuk. A kapott sötét eluátumot vákuumban bepároljuk, majd porrá liofílizáljuk. 100X2,8 cm méretű, porózus térhálós dextrán gélt (Sephadex G-50) tartalmazó oszlopot 0,1 mólos ammónium-hidrogén-karobonát-oldattal egyensúlyba hozunk, majd az előző bekezdés szerint előállított termék teljes mennyiségének 20 ml vízzel képezett oldatának pH-ját 0,88 fajsúlyú ammóniával 7-re állítjuk be és a mosófolyadékokkal együtt (2X2 ml) az oszlopra felvisszük. Az oszlopot 40 ml/óra sebességgel 0,1 mólos ammónium-hidrogén-karbonát-oldattal előhívjuk, a 350 ml és 550 ml eluátum-térfogat közötti eluátum-frakciókat egyesítjük és liofílizáljuk. Kb. 600 mg anyagot kapunk, melynek fajlagos aktivitása 100-200 /xg/kg. Az előző lépés négy szakaszából kapott anyagot az alábbi két oldószer-rendszerrel oldószeres extrakciónak vetjük alá: a) 150 ml újra desztillált terc-butanol, 150 ml víz és 30 g ammónium-szulfát; b) 300 ml izopropanol, 300 ml víz és 60 g ammónium-szulfát, mindkét elegy szobahőmérsékleten egyensúlyba hozva. 2,4 g fenti anyagot az a) rendszer alsó fázisában (40 ml) oldunk és az oldatot 100 ml-es centrifugálócsőbe helyezzük. Az a) rendszer ugyanezen alsó fázisát (30 ml) 3 további csőbe helyezzük és az első csövet az a) rendszer felső fázisával (30 ml) extraháljuk. Az extraktot egymás után valamennyi többi csőbe átvisszük és az egész eljárást háromszor megismételjük. Az egyes extrakciók között centrifugált csövekből átlátszó felső fázist kapunk. Az egyesített felső fázisokat elöntjük és az alsó fázisokat a b) rendszer felső fázisának nyolc, egyenként 30 ml-es részletével extraháljuk. A nyolc extraktot az a) rendszer alsó fázisát tartalmazó négy csövön való átvezetés után egyesítjük, vákuumban 35 C°-nál alacsonyabb hőmérsékleten bepároljuk, majd porszerű anyaggá liofílizáljuk. A kapott porszerű termék teljes mennyiségét 35 ml vízben oldjuk és 100X3,3 cm méretű, porózus térhálós dextrángélt (Sephadex G-25) tartalmazó, 0,4 mólos ecetsavval egyensúlyba hozott oszlopra, visszük fel. Az oszlopot 50 ml/óra sebességgel 0,4 mólos ecetsavval hívjuk elő és 10 ml-es frakciókat gyűjtünk össze. A biológiailag aktív anyagot a 43-68. frakcióban mutatjuk ki. Ezeket a frakciókat egyesít-5 jük és liofílizáljuk. A kapott porszerű anyag (kb. 1 g) fajlagos aktivitása 50— í 00 jug/kg. 24X3,2 cm méretű oszlopot karboxil-metil-cellulózzal (Whatman CM 52) megtoltunk és 0,01 mólos, 4,5 pH-értékű ammónium-acetát-ecetsav pufferral 10 egyensúlyba hozzuk. Az előző bekezdés szerint előállított termék teljes mennyiségének vizes oldatát (10 mg/ml) 45 ml/óra sebességgel az oszlopra felvisszük. /Az oszlopot 0,01 mólos 4,5 pH-értékű ammóniumacetát-ecetsav pufferral addig eluáljuk, míg az elu-15 átum már nem tartalmaz 280 mju hullámhosszú fényt abszorbeáló anyagot. Az oszlopot ezután 0,01 mól (pH = 4,5, 500 ml) és 0,2 mól (pH = 6,7, 500 ml) közötti koncentrációgradiensű ammónium-acetátecetsav pufferrel eluáljuk. A biológiailag aktív anya-20 got egyetlen csúcsban mutatjuk ki és az eluátumot hofilizáljuk. Az előző bekezdés szerint kapott anyag teljes mennyiségét minimäis mennyiségű (kb. 2 ml vízben) oldjuk és az oldatot 120X1,6 cm méretű porózus 25 poliakrilamid-gélt (Biogel P6, 200-400 mesh) tartalmazó 0,2 mólos ecetsavval egyensúlyba hozott oszlopra visszük fel. Az oszlopot a fenti oldószerrel 10 ml/óra sebességgel eluáljuk és 99 cseppből álló frakciókat gyűjtünk össze. A biológiailag aktív anyagot a 30 70—84. frakcióban mutatjuk ki, melyeket egyesítünk és liofílizálunk. 100 mg urogastron készítményt kapunk, melynek fajlagos aktivitása 5—10 jug/kg. 2. példa 35 10 mg 0-urogastront vagy -y-urogastront 50 ml, pirogén anyagoktól mentes vízben oldunk. Az oldatot sterilező membránszűrő rendszeren [pl. 0,22 m/u „Millipore" szűrőn, (a „Millipore" szó védjegy)] keresztül ampullákba szűrjük. Minden ampullába 0,5 40 ml oldatot töltünk. Az egyes ampullák tartalmát liofiiizáhuk, majd az ampullákat steril körülmények között lezárjuk. A 100 /ig urogastront tartalmazó ampullákat —20 C°-on tároljuk. 45 3. példa A 2. példa szerint előállított ampullák tartalmát steril, pirogén anyagoktól mentes 5 súly/térfogat%-os dextróz-oldatban oldjuk. Összesen 125 ml oldatot kapunk, mely 5 súly/térf.%-os dextróz-oldatban 0,8 50 Mg/ml urogastront tartalmaz. Az oldat infúziós úton beadagolva a savas gyomornedv kiválasztását gátolja. Injekciós oldat előállítása esetén az ampullák tartalmát 5 súly/térf.%-os dextróz-oldatban oldva 5—50 Mg/ml urogastron tartalmú oldatot kapunk. 55 Az 5 súly/térf.%-os dextróz-oldat helyett izotóniás nátrium-klorid-oldatot is alkalmazhatunk. Szabadalmi igénypontok 60 1. Eljárás nyers urogastron három komponensre történő frakcionálására, azzal jellemezve, hogy (1) 5—10 jug/kg fajlagos aktivitású urogastron készítményt 4,5 pH-jú 0,01 mólos vizes pufferrel 65 egyensúlyba hozott karboxi-metil-cellulóz-oszlopra 5