169712. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nyers urogastron három komponensre történő frakcionálására

169712 5 6 Az urogastron komponensei - mint azt a fentiekben már említettük — a savas gyomornedv kiválasztását gátolják. E hatás igazolása a következőféleképpen történik: a komponensek Heidenhain tasakkal ellátott kutyák hisztaminnal serkentett savas gyomornedvé- ,5 nek kiválasztását gátolják, továbbá pentagastrinnal serkentett gyomornedv kiválasztású emberek savas gyomornedv kiválasztását gátolják. A kutyákon végrehajtott tesztet a későbbiek folyamán, a minta fajlagos aktivitásának meghatározása során ismertetjük. Embe- 10 ren a hatást a következőképpen határozzuk meg: a betegek egy éjjelen át koplalnak, majd nazogasztrikus csövet nyelnek le. A kísérleti alanyba 0,2 ju/kg/óra mennyiségben pentagastrint tartalmazó izotóniás sóoldatot fecskendezünk és a gyomornedvet 15 perces 15 időközökben kiszívatjuk. A gyomornedv savasságát titrálással meghatározzuk; állandó mértékű kiválasztás fellépése után 0,25 ju/kg/óra mennyiségben külön infúzióval ß- vagy -y-urogastron izotóniás dextrózzal készített oldatát juttatjuk a kísérleti alany szerveze- 20 tébe. Az infúziót egy órán át folytatjuk, mialatt a savkiválasztás mértéke a korábbi állandó mennyiséghez képest 60-80%-kal csökken. A fenti fiziológiai hatás nyombélfekély kezelésénél értékes és a fenti körülmények között komolyabb 25 toxikus hatások nem figyelhetők meg. A hatóanyagok állatokon (pl. patkányon, nyúlon, vagy hörcsögön) 50 /i/kg dózisig nem mutatnak komolyabb toxikus hatásokat. A találmányunk szerinti eljárással előállítható ha- 30 tóanyagok melegvérű állatokon gyomorsav-kiválasztás gátlására az adott eset körülményeitől és az elérendő hatás mértékétől függően tág dózishatárokon belül (pl. 0,05-10 jug/kg) alkalmazhatók. A hatóanyagot injekció (különösen intravénás injekció) 35 vagy intravénás infúzió formájában adagolhatjuk. A hatás időtartama mindkét esetben az injekció vagy infúzió beadásának befejezése után kb. 1,5 óra. Emberen a hatékony dózis injekció vagy infúzió esetében 5—500 fig. Nyombélfekély esetében a dózis 40 többször adagolandó vagy depot készítmények alkalmazandók. Az urogastron fentiekben ismertetett komponenseit gyógyászati készítmények alakjában adagolhatjuk. Találmányunk továbbá a fenti urogastron kom- 45 ponenst vagy komponenseket és gyógyászatilag alkalmas hígító- vagy hordozóanyagokat tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására is vonatkozik. A készítményekben hatóanyagként előnyösen ßurogastront vagy 7-urogastront alkalmazhatunk. A 50 készítményeket előnyösen parenterális adagolásra alkalmas formában készíthetjük ki. A hatóanyagot előnyösen steril injiciálható oldatok vagy szuszpenziók, steril injiciálható depot készítmények vagy steril hígító- vagy oldószerekben feloldható vagy szuszpen- 55 dálható steril porkészítmények alakjában formulázhatjuk. A fenti injiciálható oldatok vagy szuszpenziók segítségével a hatóanyag közvetlenül elosztható a páciens testében; e készítmények hatóanyag-tartalma 0,5-500 Mg/ml- A depot készítményekből a ható- 60 anyag lassan jut a testnedvekbe, ezek hatóanyag-tartalma 2 mg-ig fokozható. A steril injiciálható oldatok előnyösen steril izotóniás sóoldatok vagy izotóniás dextrózoldatok lehetnek. Találmányunk további részleteit az alábbi 55 példákban ismertetjük, anélkül, hogy azt a példákra korlátoznánk. A példákban az alábbi specifikus kromatografáló anyagokat alkalmazzuk (a gyártó cég védjegyére vagy a kereskedelmi elnevezésre hivatkozunk.) Karboxi-metil-cellulóz, Whatman CM 52, gyártó cég: W. R. Balston Ltd, Maidstone, Kent, Nagy-Britannia. Porózus pohakrilamid-gél, az 5000-nél nagyobb molekulasúlyú molekulák kizárásával, Biogel P 6; gyártó cég: Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA. Amino-etil-cellulóz, A-E. Cellex, gyártó: Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA. Kovasavgél, Celite 545, gyártó cég: Johns Manvüle (Nagy-Britannia) Ltd, Richmond, Surrey, Nagy-Britannia. Gyengén bázikus ioncserélő gyanta, Deacidite G-IP 3-5% DVB, gyártó cég: The Permuit Company, Isleworth, Middlesex, Nagy-Britannia. Porózus térhálós dextrángél, Sephadex, G-50 és G—25, gyártó cég: Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Svédország. Minden egyes, kromatografáló oszlopot felhasználó lépésnél az eluátumot meghatározott cseppből álló frakciókba gyűjtjük Ultrorac LKB 7000 frakciógyűjtő berendezés segítségével (LKB Instruments Ltd, Croydon, Surrey, Nagy-Britannia) és a frakciók peptidanyag-tartalmát a 280 mju-nál mutatott ultraibolya abszorpció meghatározásával mérjük. Az anyagot frakciókba gyűjtjük és biológiai aktivitását a következőképpen határozzuk meg: Szeparált, idegeitől megfosztott fundus tasakkal rendelkező kutyák gyomorsav-kiválasztását hisztamin szubkután befecskendezésével a maximális érték 60-80%-a körüli értékre fokozzuk [óránként általában 0,48 ml, 600 jug hisztamint (bázisban kifejezve) tartalmazó oldatot juttatunk infúzió útján az állat szervezetébe]. Ismert súlyú tesztvegyületet izotóniás sóoldatban oldunk és amikor a kutya gyomornedv kiválasztása állandó értéket vesz fel, az ismert mennyiségű hatóanyagot egyetlen intravénás injekcióval beadjuk. A gyomornedv-kiválasztás gátlását feljegyezzük és a megfelelő görbéből az 50-70%-os gátlást előidéző dózist (Mg/kg) kiszámítjuk). Az aminosav elemzéseket Locarte-féle aminosav elemző berendezéssel (Locarte Ltd., 24 Emperors Gate, London S. W. 7.) végezzük el. Valamennyi oszlopkromatografálást 4 C°-on végzünk el és minden esetben toluollal telített pufferoldatokat alkalmazunk. 1. példa Nyers urogastron szétválasztása három komponensre 20 cm hosszú és 1,4 cm átmérőjű oszlopot karboxi-metil-cellulózzal (Whatman CM 52) töltünk meg és 0,01 mólos, 4,5 pH-értékű nátrium-acetátecetsav pufferrel egyensúlyba hozzuk. 100 mg urogastron készítményt (fajlagos aktivitás 5—10 Mg/kg) 20 ml vízben oldunk és 15 ml/óra sebességgel az oszlopra felvisszük. Ezután az oszlopot a fenti adagolási sebességgel 5,0 pH-értékű nátrium-acetát-ecetsav pufferrel eluáljuk; a koncentrációgradiens 0,01-0,5 mól (minden pufferből 200 ml-t alkalmazunk) és 100 cseppből álló frakciókat gyűjtünk össze. A 46-54. frakcióban biológiailag aktív anyagot mutatunk ki, 3