169462. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Litoralon koncentrátum, vagy keverék előállítására
11 169462 12 A továbbiakban a zsírtalanított és vízmentes mirigyport 3x100 ml desztillált vízben szobahőkofon nitrogénatmoszférában l-l órán át extraháljuk. Az extrakciós lépések között a mirigyport a kivonattól nagysebességű laboratóriumi centri- 5 fugával távoHtjuk el. Az extraktumokat feldolgozásig 3-5 C -on nitrogénatmoszférában tároljuk. A vizes kivonatok ninhidrin, biuret és triklórecetsav reakciója .pozitív. A vizes kivonatokat ezek után összegyűjtjük és annyi 50 térfogat-százalékos vizes 10 triklórecetsav-oldatot csepegtetünk hozzá állandó rázogatás közben, hogy a végső triklóre cet savas koncentráció 15%-os legyen. 1 órás 3-5 C°-on történő állás után a triklórecetsavas üledéket centrifugáljuk. A felülúszó éles, halványsárga színű vizes 15 oldat triklórecetsav reakciója negatív, ninhidrin reakciója pozitív. A triklórecetsav felesleget ezután éterrel (1-1,2 térfogat éter : 1 térfogat víz arányában) 20 szobahőfokon történő sorozatos extrakcióval távolítjuk el. Általában 17-18-szoros extrakció szükséges a triklórecetsav maradéktalan eltávolításához. A gyakorlatban a biztonság kedvéért 20-25 extrakciót végzünk. Az utolsó extrakció után a vizes 25 fázis pH-jának 4,5 - 5 között kell lennie. A vizes fázis étermentesítését nitrogénáramban, vízsugárszivattyú segítségével 30 C°-t meg nem haladó hőmérsékleten végezzük. A térfogatcsökkenéssel járó étermentesítés időtartama 6 óra (a vizes 30 fázis egyrésze is ledesztillá). Az étermentesítés befejeztet szaglással is ellenőrizzük. A vizes oldatot ezután liofilizáljuk és a kapott terméket jól záró edényben tároljuk további fel- 35 használásig (higroszkópos). Az eredeti kiindulási mirigyporra vonatkoztatott kitermelés (zsírtalanítás előtti anyagra) a zsírtartalomtól függően 10-15%. 40 2. példa Az 1. példa szerint a zsírtalanított mellékpajzsmirigyből egy kivonat készült, mely fehérjétől és lecsapószertől mentes. 5 g-ot a triklórecetsav in- 45 aktív üofilizátumból egy Saphadex G15 -öt tartalmazó oszlopon gélfitrálunk. Az oszlop méretei: 4,3 x 144 cm. Az eluens víz, átfolyási sebesség 60 ml/óra, frakcióméret 15 ml. " Az összegyűjtött liofilizált minták súlya: -s 0 55 60 Csövek száma Súly (mg) 46-83 913 84-98 1 126 99-118 999 119-136 1416 137-154 24 155-170 3 185-198 19 221-230 2 238-265 15 279-285 1 Összesen: 4 518 mg (98%) 65 A főfrakció (csőszám 46-83 között) 913 mg anyagtartalommal már aránylag Litoralonban dús és kifejezett fiziológiai, illetve gyógyászati hatással rendelkezik 5-10/^g/kg testsúly arányban történő adagolás esetén. Ez az az anyag, mely a gélfiltráció első két csúcsában van jelen. A frakciók szétválasztása célszerűen a következő módszerek szerint történik: a) Spektrofotometrikus abszorpció mérése 280 mM-nél, b) Spektrofotometrikus abszorpció mérése 234 mu-nél, c) Spektrofotometrikus abszorpció mérése 360 m/i-nél, d) Az elektromos vezetőképesség mérése: e) Kvalitatív vizsgálat klorid ionra ezüstnitrát reagenssel, f) Az egyes csúcsok egyesített frakcióinak pH mérése, g) Vizsgálat ninhidrin reagenssel, h) Puszta szemmel való vizsgálat opaleszcenciára és színre (sárgás). A főfrakció (46-83 csőig) kitermelése száraz, nem zsírtalanított mellékpajzsmirigyporra számítva 2 - 2,5%. 3. példa A 2. példa szerint járunk el azzal a különbséggel, hogy a két első csúcsot külön főfrakciókban fogjuk fel. Ily módon 5 g fehérjementes vizes kivonatból 302 mg-os I főfrakciót és 555 mg-os II főfrakciót állítunk elő. Ezután a II főfrakciót ismételt gélfiltrálásnak vetjük alá. Az oszlopra 456 mg anyagot viszünk fel és eluensként vizet alkalmazunk. Oszlopméret 4,3x144 cm, átfolyási sebesség 50 ml/óra. Frakcióméret 10 ml, oszloptöltet Sephadex Gi5. Ily módon a II főfrakció további 3 csúcsra bontható. A középső csúcshoz tartozó frakciókat egyesítjük. Súly liofilizálás után 237,5 mg. Kitermelés nem zsírtalanított mellékpajzsmirigyporra számítva 0,6 - 0,8%. Jellemző tulajdonságok: sárga higroszkópos anyag, C, H, N, O és S tartalommal. Ez a frakció fiziológiai, illetve gyógyászati hatással rendelkezik már 10 Mg/kg testsúly aranyban történő adagolás esetén is. A termék kromatográfiásan vagy más módszerekkel tisztítható tovább. Egy cellulóz, vagy ioncserélő oszlop segítségével a szennyező aminosavak (lizin, glutaminsav stb.) eltávolíthatók. Ily módon primer kiindulási anyagra számított 0,3 - 0,4%-os kitermeléssel egy még mindig szennyezett Litoralon állítható elő, mely azonban 5 Mg/kg testsúly koncentráció alatt is biológiai hatást mutat. 4. példa Az 1. példában leírt terméket Sephadex G15 -ön (Pharmacia, svéd gyártmány, szemcseméret 90 x 120 ju) leszálló technológiával gélfiltráljuk. Az 6
