169436. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és analitikai reagens haptének kimutatására és meghatározására

3 169436 4 zésbe. Minden hígításnál meghatározzuk, hogy mennyi haptén-enzim konjugát kötődött az antitestekhez, így például választunk egy olyan antiszérum-hígítást, amelyben a haptén-enzim konjugát 80%-ban kötődik, és ehhez a hígításhoz változó mennyiségű haptént adunk. Minden haptén-koncentrációhoz meghatározzuk, hogy mennyi haptén-enzim konjugát kötődött, így például 1 egység hapténnál a konjugát 78%-a és 2 egység hapténnál a, konjugát 75%-a stb. így azután, ha a haptén-enzim konjugát és az antiszérum fent említett mennyiségeit adjuk a hapten ismeretlen mennyiségéhez és mérjük az enzim aktivitását a megkötött vagy a meg nem kötött haptén-enzim konjugátot tartalmazó frakcióban, a vizsgálandó folyadékban levő hapten mennyisége meghatározható. A fentiek alapján világos, hogy abban az esetben, ha a haptén-enzim konjugálnak az antiszérum iránti aktivitása nagyobb, mint a hapténnak az antitest iránti aktivitása, akkor ahhoz, hogy a kiszorítási reakció kellőképpen végbemenjen és mérhető enzimaktivitást kapjunk a folyadékfázisban viszonylag nagy mennyiségű hapténnak kell jelen lennie. Ezért ha a hapténnak az antitestek iránti viszonylagos aktivitását növelni lehetne, vagy a másik utat választva csökkenthetnénk a haptén-enzim konjugát antitestek iránti aktivitását, a vizsgálati rendszer érzékenysége megnövekednék, és így a rendszenei igen kis haptén-koncentrációkat is meg lehetne határozni. Meglepő módon azt találtuk, hogy a fenti meghatározási módszer érzékenysége jelentősen növekszik, ha a hapten és az enzim közötti kötés természete eltér az antitestek képzésére használt anyagban levő hapten és nagymolekulájú vegyület közötti kötés természetétől. Eltérő természetű haptén-enzim kötésen és haptén-nagymolekulájú vegyület kötésen ezúttal az alábbiakat értjük: a) kémiai szempontból eltérő kötést vagy hidat, b) kémiailag eltérő, de immunológiai szempontból hasonló hapténeket tartalmazó konjugátot, illetve antitest-indukáló anyagot, c) a haptén-molekula eltérő helyzeteinél való kapcsolódást, d) az a), b) és c) esetek kombinációját. A haptének többnyire kismolekulájú protein-mentes anyagok, amelyek nem képesek antitest-képződést kiváltani, azonban reagálnak az antitestekkel. Az utóbbiak akkor képződnek, ha a haptént egy nagymolekulájú vegyülettel, rendszerint egy polipeptiddel vagy fehérjével kapcsolják össze, és a kapcsolt terméket embereknek vagy állatoknak beadják. A hapténekre példaként az alábbi vegyületeket említjük meg: szteroidok, így ösztron, ösztradiol, ösztriol, tesztoszteron, pregnadiol, progeszteron, vitaminok, így pl. Bi2 vitamin és fólsav, tiroxin, trijód-tironin, hisztamin, szerotonin, digoxin, prosztaglandinok, adrenalin, nor-adrenalin, morfin, növényi hormonok, így például auxin, kinetin, és giberellinsav, antibiotikumok, így például penicillin. A haptén-enzim konjugát előállításához a komponensek már meglevő szubsztituenseit, így például 5 a hidroxil-, karboxil-, amino- vagy keto-csoportokat lehet használni. Ha e csoportok egyike sincs jelen, akkor bevihetjük őket, különösen a hapténekbe. így például a szteroid molekula több helyzetébe, így például 6-, 11- vagy 16-helyzetébe mikrobioló-10 giai vagy kémiai úton hidroxilrcsoportot vihetünk be. Az ilyen hidroxil-vegyületeket polikarbonsawal vagy annak egy funkciós származékával lehet az enzimhez kapcsolni. Oly módon is eljárhatunk, 15 hogy egy keto-csoportot tartalmazó hapténbol vagy olyan hapténbol indulunk ki, amelybe ilyen csoportot bevittünk, azután a karboxialkoxim-származékon keresztül kapcsoljuk az enzimhez. Ha mind a hapten, mind az enzim amino- vagy karboxil-20 -csoportokat tartalmaz, akkor a két komponenst a peptidszéntézisből ismert módon lehet összekapcsolni. Megfelelő szubsztituensek jelenlététől függően más vegyületek, így dialdehidek, például glutáral-25 dehid, hidrazinok, difluordinitrodifenilszulfon, diizocianátok, például toluol-diizocianát és di- vagy triklótriazinok is használhatók a kapcsoláshoz. A konjugát képzéséhez elvileg bármilyen típusú 30 enzimet választhatunk, előnyösen azonban olyan enzimet használunk, amely egyszerű módon, például kolorimetriásan, spektrofotometriásán vagy fluorometriásan meghatározható nagy fajlagos aktivitással rendelkezik. 35 Ilyen enzimekre példaként megemlítjük a kataláz, peroxidáz, glükuronidáz, glükozidáz, galaktozidáz, ureáz és oxidoreduktáz enzimeket, mint amilyen például a glükóz-oxidáz és a galaktóz-oxidáz. A szilárd vagy folyékony fázisban levő haptén-40 -enzim konjugát enzimaktivitását úgy határozzuk meg, hogy a konjugátot az enzim valamely szubsztrájával indukáljuk egy megfelelő akceptor jelenlétében. (FEBS Letters, 15, (1971), 232.) A hapten elleni antitestek előállítása végett a 45 haptént egy nagymolekulájú anyaggal, rendszerint egy proteinnel kapcsoljuk, beadjuk az állatnak, azután az antitestet a szokásos módon elkülönítjük. A hapten és a protein vagy az esetleges más, 50 antitest képződését kiváltó nagymolekulájú anyag összekapcsolására ugyanazokat a módszereket lehet használni, amelyeket a fentiekben a hapten és az enzim összekapcsolására ismertettünk. A találmány szerinti eljárás szempontjából azon-55 ban lényeges, hogy az így kialakított kötésnek különböznie kell a haptén-enzim konjugátban levő kötéstől. A különbségnek kémiai természetűnek kell lennie. így például ha a haptén-enzim konjugátban a kötést polikarbonsawal létesítettük, akkor 60 a hapten és a protein közötti kötés például egy karobiximetiloxim-híd lehet. Lehetséges az is, hogy a kötést mindkét esetben polikarbonsav segítségével alakítjuk ki, (így például egy dikarbonsawal), akkor azonban az egyik esetben X szénatomot, pél-65 dául két szénatomot tartalmazó dikarbonsavat, 2