169326. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek előállítására aktivészteres módszerrel katalizátorok hozzáadása útján
7 169326 S Éppen a hozam növelése döntő az ilyen típusú szintézisek sikere szempontjából szilárdtest módszereknél. Sztérikusan erősen gátolt inzulin-A-lánc szekvenciából származó pentapeptidnél is megmutatkozik a találmány szerinti adalékanyagok előnye (vö. 16. példa). Á találmány szerinti eljárás elsőnek biztosít egy olyan módszert, amellyel a szilárdtest szintézisnél különösen előtérbe kerülő sztérikus gátlás kiküszöbölhető. A találmány szerinti eljárás alkalmazása nem csak a kisebb molekulasúlyú peptideknél előnyös. A nagyobb molekulasúlyú peptidek mint az N(A1 >, N<B29 >-bisz-Boc-inzulin [Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 7 352, (1971)], vagyis egy 51 aminosavból felépített komplikált peptid is néhány perc leforgása alatt N-acilamino savval és N-acilpeptid-aktívészterrel a megfelelő N(B1 )-N-acilamino-sav illetve N<B1 >-N-acilpeptid-N< A1 ), N<B29 )-bisz-Boc-inzilinokká simán átalakítható. A III általános képletű vegyületek olyan proteinek is lehetnek, amelyeknek szabad amino-csoportja teljesen vagy részben a II általános képletű vegyületekkel reakcióba lép. Különösen kedvezőtlen oldhatósági viszonyoknál jól bevált például vizes dimetilformamid használata. Megfelelő proteinek közé tartoznak például a zselatinok, amely részben szérumalbuminná vagy kazeinné lebonthatók. A védőcsoportok lehasítása után a II általános képletű vegyületekből N<A1>, N< B29 >-bisz-Boc-inzulinnal előállított reakciótermékek magas biológiai hatásosságuk mellett megváltozott fizikai-kémiai és immunológiai tulajdonságokkal rendelkeznek, amelyek új inzulinkészítmények előállítása szempontjából előnyösek. A II általános képletű vegyületekből proteinekkel előállított reakciótermékek adott esetben a védőcsoportok lehasítása után olyan antigének előállítására hasznosíthatók, amelyek a II általános képletű vegyületek alapjául szolgáló aminosavak vagy peptidek ellen használhatók. A találmány szerinti eljárással készült peptidek alapanyag-komponenseiként minden természetben előforduló peptidhez hozzátartozó L- vagy D-formában levő aminosav számításba jön. Felhasználhatók 0-aminosavak, mint pl. a 0-alanin vagy más szintetikus vagy félszintetikus úton hozzáférhető aminosavak, mint az a-metilalanin, a-metil-3,4--dioxi-L-fenilalanin vágy a 0-klóralanin. A találmány szerinti eljárás különösen előnyösnek bizonyult. Az eddigiekben számos esetben szükséges hosszú reakcióidők néhány percre csökkenthetők. Ez különösen pl. a nitrofenilészter-módszernél jelent különös előnyt, amely a leggyakrabban használt peptidkondenzációs módszerekhez tartozik. Főként peptidek ipari előállításánál jelent a találmány szerinti eljárás nagy műszaki haladást, mivel az időegységben előállítható mennyiség rendkívül nagy arányban növelhető. A találmány szerinti eljárás különleges előnyéhez tartozik, hogy a találmány szerinti N-hidroxi-vegyületek katalitikus hatása főként a fentiekben felsorolt erősen poláros oldószerekben jut érvényre, amelyek jó oldhatósági tulajdonságaik következtében kizárólag nagyobb molekulasúlyú peptidek szintézisénél jönnek számításba. A találmány szerinti eljárással készült peptidek a 5 védőcsoportok lehasítása után gyógyszerként vagy köztitermékként használhatók más gyógyászatüag hasznos peptidek, mint például az Oxitocin, vazopresszin, glukagon, szekretin, ACTH, tirokalcitonin, gasztrin, TRH, LRH vagy inzulin előállításánál. 10 A leírásban és a példákban az aminosavakat a nemzetközileg elfogadott szabályok szerint rövidítettük [vö. Hoppe-Seyler: Z. Physiol. Chem. 348, 256 (1967)]. Ezen kívül a következő rövidítéseket 15 használjuk: Boc terc-butiloxikarbonil-csoport, Z benziloxikarbonil-csoport, Nps o-nitrofenilszulfonil-csoport, OBu* terc-butiloxi-csoport, OMe metoxi-csoport, OBzl benziloxi-csoport, ONp p-nitrofeniloxi-csoport, OTcp 2,4,5-triklórfeniloxi-csoport, OPcp pentaklór-feniloxi-csoport, OSu N-oxiszukcinünid-csoport, Trt tritil-csoport, Bu* terc-butil-csoport, Mbh 4,4'-dimetoxi-benzhidril-csoport, CHA ciklohexilamin-csoport. A példákban leírt sóoldatokon telített sóoldatok értendők, amennyiben egyéb koncentrációadat nincs feltüntetve. 35 1. példa A felezési idők meghatározása Z-Val-ciklohexilamid szintézisénél moláris mennyiségű Z-Val-ONp és ciklohexilamin felhasználásával különböző 40 N-hidroxi-vegyületek hozzáadása útján, továbbá a felezési idők függése az N-hidroxi-vegyületek pK-értékétől. a) A felezés idők meghatározása 45 I. oldat: 0,5 nmól ciklohexilamin, 0,5 nmól p-nitrofenol és 1,0 nmól N-hidroxi-vegyület lml dimetilformamidban: II.oldat: 1,0nmól p-nitrofenil lml dimetüfor-50 mamidban: III. oldat: 1,0 nmól N-hidroxi-vegyület 1 ml dimetilformamidban : Az I, II és m oldat UV-görbéjét (330-300 jxméter hullámhossztartomány) egymással 55 összehasonlítjuk abból a célból, hogy a p-nitrofenol mérésére a kedvező hullámhossztartományt megha^ tározzuk. Ennél a hullámhossznál mérjük az extinkciót. Az I oldat alapján kapott érték extinkciójához hozzáadjuk 1 nmól Z-Val-ONp és 1 nmól 60 trietilamin lml oldatra számítva meghatározott 50%-os extinkciós értékét a fentiekben megválasztott hullámhosszaknál. A két extinkció összege képviseli azt az extinkciós értéket, amelynél a Z-Val-ONp fele mennyisége a ciklohexilaminnal 65 reakcióba lépett. 4
