169326. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek előállítására aktivészteres módszerrel katalizátorok hozzáadása útján
169326 27 b) Boc-Gry-Ile-Val-Glu(OBzl)-Gln(Mbh)*-polimer vegyület 6 g Nps—Gln(Mbh)-műgyanta vegyületet üvegszűrővel felszerelt reakcióedényben Merrifield sze- 5 rint a következő reakcióciklusnak vetjük alá: 28 bi ): mosás 3 x 50 ml jégecettel, b2 ): N-védőcsoportok lehasítása 1 n jégecetes vízmentes sósavoldattal történő félórás rázogatással, szűrés, b3 ): mosás jégecettel, bj szerint, b4): háromszori mosás 50-50 ml etanollal, b5 ): háromszori mosás 50-50 ml dimetilfor mamiddal, b6 ): a gyanta felszabadított a-aminocsoportjain jelenlevő hidroklorid-csoportok semlegesítése 50 ml 10%-os trietilamin dimetilformamidos oldatával történő 10 perces rázogatással, b7 ): ismételt mosás dimetilformamiddal bs ) szerint, b8 ): 3,6 mmól megfelelő Boc-aminosav-triklórfenilészter dimetilformamidos oldatának beadagolása (40 ml dimetilformamid) 0,57 g (3,6 mmól) 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-kinazolinnal, végül 2 órás rázogatás, majd szűrés, b9 ): dimetilformamidos mosás bs ) szerint, bio): vízmentes etanollal történő mosás b4) szerint. 10 15 20 25, 30 Az előbbiekben leírt mosási műveletek mindenkor 3 percet vesznek igénybe. Ezután az oldószert nyomószűréssel (0,3 att) az üvegszűrőn keresztül a 35 reakcióelegyből eltávolítjuk. Egy-egy aminosavnak a szekvenciába történő bekapcsolásához mindenkor az előbb leírt bt — bi0 ) ciklust egyszer végrehajtjuk. A ciklus végrehajtásánál egymást követően a következőkben felsorolt Boc-aminosav-2,4,5-triklórfenilésztereket alkalmazzuk mindenkor a b8 ) lépésben a fenti sémának megfelelően: Boc-Glu(OBzl)-OTcp, Boc-Val-OTcp, Boc-Ile-OTcp és Boc-Gly-OTcp 40 45 A hozam Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBzl)-Gln(Mbh)-polimer vegyületre számítva nagy- 50 vákuumban 80 C -on foszforpentoxid feletti szárítás után 5,3 g, peptid-tartalom 8,2%. A pepiid-tartalmat savas hidrolízissel és kvantitatív aminosav meghatározással állapítjuk meg. 55 c) A peptid felszabadítása 3 g b) szerint előállított acilpeptid-polimer vegyületet a fenti reakcióedényben 20 ml vízmentes 60 trifluorecetsavban szuszpendálunk, végül 90 percig nedvesség kiszárítása mellett a reakcióedény üvegszűrőjén keresztül alulról lassú vízmentes hidrogénbromid-áramot vezetünk a fritt fölött elhelyezkedő szuszpenzión keresztül. A szuszpenziót ezután szűr- 65 jük és a gyantát 3x10—10 ml trifluorecetsawal mossuk. Az egyesített trifluorecetsavas szűrleteket és mosóoldatokat vákuumban bepároljuk, a maradékot dekantálással 2 x 50-50 ml vízmentes éterrel eldörzsöljük. Nagyvákuumban foszforpentoxid felett történő szárítás után 396 mg anyaghoz jutunk, amelynek olvadáspontja 225 C°-tól kezdve bomlik, MD =-51,4° (c = 0,25, vízben). 200 mg nyers termékből Sephadex LH 20 gyantán végzett megosztásos kromatográfiával 2:1:10 arányú butahol/ecetsav/ víz oldószer-rendszerben 114 mg színtelen amorf anyaghoz jutunk Olvadáspont 240 C (homlik), [aß2 =-71,4° (c = 0,25, vízben). Aminosav analízis: lásd 4. táblázat. II. Előállítás szilárdfázis-peptidszintézis-módszerrel 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-kinazolin hozzáadása nélkül. Ennél a kontroll kísérletnél a teljes előállítási eljárást mind kvalitatív, mind kvantitatív szempontból minden tekintetben I. szerint végeztük azzal az eltéréssel, hogy a b8) lépésben nem adagoltunk 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-kinazolint. Az összehasonlító vizsgálatnál egyenként a következő eredményekhez jutottunk: nyershozam: 420 mg, olvadáspont 96 C°-tól kezdve bomlás, [a]o2 = -27° (c = 0,25, vízben). Sephadex LH 20 műgyanta segítségével végzett megosztásos kromatográfiával 206 mg nyerstermékből csak 84 mg alábbi fizikai jellemzőkkel rendelkező anyag állítható elő: olvadáspont: bomlás 165C°-tól, [a]2D 2 =-34,9°, (c = 0,25, vízben). Eloszlási kromatográfia - Sephadex LH 20 oszlopon 2:1 :10 arányú n-butanol-ecetsav-víz rendszerben — szerint nem egységes. Aminosav analízis: lásd 4. táblázat. III. Előállítás szokásos módszerekkel. a) Boc-Gly-Ile-OH • CHA 35 g (0,2 mól) Boc-Gly-OH, 38,4 g (0,2 mól) H-Ile-OMe • HCl és 27 g (0,2 mól) 1-hidroxi-benzo-triazöl 350 ml dimetilformamidban készült oldatához 26 ml N-etilmorfolint és 0 C°-on 44 g diciklohexilkarbodiimid 50 ml jéghideg dimetilformamidban készült oldatát adjuk. A reakcióelegyet 1 óra hosszat 0 C°-on és 1 óra hosszat szobahőmérsékleten keverjük, a csapadékot leszívatjuk és a szűrletet bepároljuk. A maradékot etilacetát és nátriumhidrogénkarbonát oldat között megosztjuk. Az etilacetátos fázist 5%-os káliumhidrogénszulfát oldattal, nátriumhidrogénkarbonát oldattal és vízzel kirázzuk, nátriumszulfáton megszárítjuk és bepároljuk. Hozam 61,1 g olaj. Az olajos terméket etilacetátban oldjuk és azt 185 g bázisos alumíniumoxid (Woelm, I aktivitási fok) tartalmú oszlopon kromatografáljuk. Az etilacetátos eluátumot bepároljuk. A hozam 55,8 g. 14
