169321. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív kondroitinszulfát előállítására porctartalmú szervekből

3 169321 4 kológiai hatású kondroitinszulfátot, hogy a parciális hidrolízist erősen savas kationcserélő gyantával végzik 90-100 C°-on. További eredményes megoldást jelentett a természetes forrásból történő izolálás kiegészítése va- 5 lamilyen „aktiválási" lépéssel. Az 1 590 066 sz. francia szabadalmi leírásban a fiatal állatok szerveiből készült porcport oxigén kizárásával 5—50 órán át magas hőmérsékleten tartják, és így sebgyógyulást elősegítő készítményt nyernek. 10 Ugyancsak „aktívált" kondroitinszulfát előállításáról számol be a 2 037 942 sz. NSZK szabadalmi leírás, amely az állatkísérletes adatokon kívül ismerteti a készítmény emberi terápiában való felhasználásának eredményeit is. Az előállítás első lépésében aceton- 15 nal zsírtalanított marha-légcső vagy hal-porc papaionos emésztését végzik, majd az oldatban jutott makromolekulákat acetonnal kicsapják. Ezt követően a feloldott csapadékot annyi káliumpermanganáttal kezelik, amennyi azt még oxidálni 20 képes, végül szerves oldószerrel kicsapva kapják az „aktív" kondroitinszulfátot. Mindezen eljárásoknak hosszadalmasságuk mellett az a hátrányuk, hogy a biológiailag hatásos kondroitinszulfát mennyisége a keletkezett végter- 25 mékben bizonytalan. Szemléletesen érzékelteti ezt a 2 037 942 sz. NSZK szabadalmi leírás, eszerint a nyert termékek között sarzsonként hatásosak és hatástalanok váltakoznak, jóllehet kémiai összetételükben értékelhető különbségeket nem találtak. 30 A találmány célja értékes biológiai hatással rendelkező kondroitinszulfát előállítása. Ilyen hatást képvisel a keringő vér és az érfal kapcsolatában a lipoprotein-hidrolízis („clearing") és a fibrinolízis 35 folyamatának megindítása, amely a lipoprotein-lipáz és a fibrinolízin in vivo aktiválásán alapul. Ezek az enzimreakciók az érelmeszesedés, a zsíranyagcsere és véralvadás zavarainak befolyásolásában emelkednek terápiás értékűvé [Angew. Chemie, 72, 663 40 (1960), Chemotherapia 3, 388 (1961), Lipoproteidhpase, Symposium, Wien, 127 (1963), Circulation, 48, Suppl., 4, 215 (1973)]. A találmány alapja az a felismerés, hogy porc- 45 szövetet tartalmazó állati szervek, előnyösen a sertés- vagy juh-légcső és a marha porcos orrsövény, alkálifém-halogenid gyengén savas vagy semleges vegyhatású és 0,1 - 3 mól töménységű vizes oldatával 15-25 C°-ön történő kivOnatolásával olyan 50 szervmaradék nyerhető, amelynek proteázt és amilázt egyaránt tartalmazó erizimkeverékkel pH 7-8 vegyhatású vizes közegben végzett feltárása után nyert kivonatából ismert módon szilikát alapú adszorbenssel végzett derítést követően vízzel ele- 55 gyedő szerves oldószerrel biológiailag aktív kondroitinszulfát csapható ki. Ez a felismerés azért meglepő, mert az irodalmi adatok alapján nem volt várható, hogy frakcionáló 60 kioldás, vagyis a porcszövetnek vizes sóoldattal történő kivonatolása után a szervmaradék enzimes kezelése olyan kondroitinszulfátot juttat oldatba, amely lipoprotein-lipázt és fibrinolizint aktiváló képességgel rendelkezik. A sóoldat alkalma- 65 zásának körülményei mellett ugyanis nem várható, és a készítmények viszkozitás-adatai alapján nem is következett be (lásd az 1. táblázatot) sem hidrolitikus lebontás, sem oxidáció, vagyis azok a hatások, amelyek az említett leírásokban biológiailag aktív kondroitinszulfáthoz vezettek. Továbbmenően, a porctartalmú szervek híg nátriumklorid oldattal történő kezeléséről az ismert, hogy így a kondroitinszulfátot is tartalmazó proteoglikán makromolekulák egy része kioldódik [Biochem. J. 113, 885 (1969), Biochem. J., 139, 565 (1974)]. A kioldó hatás még fokozódik a sókoncentráció növelésével [J. Biol. Chem., 119, 507 (1937), J.Biol. Chem., 185, 725 (1950)]. így az volt várható, hogy a sóoldattal végzett kivonatolás utáni maradékból kevesebb kondroitinszulfát állítható elő, mintha annak elhagyásával, tehát az enzimes kezeléssel kezdjük a műveletsort. Kísérleteink során ezzel ellentétben azt találtuk, hogy a sóoldattal történő kivonatolást is magában foglaló műveletsor esetén a végtermék mennyisége meghaladja a 10 g/kg sertésgége kitermelést. Ugyancsak meglepő az a tény, hogy a vizes sóoldattal kivonatolt szervből előállított kondroitinszulfát a vizsgált biológiai tesztekben aktívnak bizonyult, szemben a kivonatolás nélkül nyert termékkel (1. táblázat). Az összehasonlító kémiai és fizikókémiai vizsgálatok ugyanakkor érdemleges különbséget nem mutattak ki közöttük (1. táblázat). A fentiek alapján a találmány eljárás biológiailag aktív kondroitinszulfát előállítására porc-tartalmú szervekből frakcionáló kioldás, a hatóanyagot tartalmazó kivonat derítése, majd a hatóanyag kicsapása útján. A találmány értelmében a frakcionáló kioldást pH = 4 - 7,5 értéken, 0,1 - 3 mól töménységű vizes-alkálifém-halogenid-oldattal végzett kivonatolással, az oldatlan rész elkülönítésével, majd proteáz- és amiláz-tartalmú enzimkeverék jelenlétében pH = 7-8 értéken, 0,2 - 1 mól töménységű vizes alkálifém-halogenid-oldattal történő kezeléssel végezzük. A porc-tartalmú szerv kivonatolásához előnyösen 1—2 mól NaCl oldatot alkalmazunk pH 5,5 vegyhatás mellett. Az eljárás lényeges tényezője, hogy a szervmaradék enzimes feltárásakor a végtermék mennyisége növelhető, ha adott proteolitikus aktivitás mellett az amiláz-tartalmat megnöveljük (1. táblázat). Az enzimes kezelésnél előnyösen minden kg szervhez 20 Anson E [J.Gen. Physiol., 22, 79 (1939)] proteáz aktivitású és 100 000 SKBE [Cereal., 16, 712 (1939)] feletti amiláz aktivitású enzimet adunk és 0,2 - 1 mól NaCl tartalmú vizes 0 oldattal kivonatoljuk 45—50 C hőmérsékleten. A találmány szerinti eljárás legfőbb előnye, hogy viszonylag rövid úton és reprodukálhatdan vezet magas tisztaságú az elméletivel közel egyező N/S arányt mutató és biológiailag aktív kondroitinszulfáthoz. Ennek szemléltetésére az 1. táblázat középső oszlopában mutatjuk be a találmány szerint előállított termék jellemző adatait és egyben összevetjük a felismerés előnyeit fel nem használó hasonló eljárásokkal nyert termékek adataival. 2