169253. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2. szerotipusú Herpes simplex élő vírusvakcina előállítására

3 169253 4 Számos 2. szerotípusú Herpes vírus vakcina ismert (BSM 2300 számú francia szabadalmi leírás, P. Santoianni, Minerva Dermatologica 41, p. 30-35, 1966., R. Degos et R. Touraine, Bull. Soc. Franc. Derm. Syph. 71, p. 161-66, 1964., R.C.Godfrey, Br. J.Exp. Path. 53., p. 529-39, 1972., Rodovsky et al., Derm. Monatsch. 157, p. 701-08, 1971. és Th. Nasemann und G. Schaeg, Der Hautarzt 24, p. 133-39, 1973.), azonban eddig nem volt ismert élő, 2. szerotípusú Herpes vírus vakcina. A találmány kidolgozásakor figyelembe vettük a fentiekben ismertetett akadályokat és a találmány lényegében abban áll, hogy hőre érzékeny Herpes vírus mutáns törzseket izolálunk és legalább egy ilyen hőre érzékeny mutáns törzset viszünk be a szervezet valamely hidegebb részébe, így a nyálkahártyába vagy a bőrbe, különösen intradermálisan (például oltással). A fenti vakcinázási módot például a 2. szerotípusú Herpes simplex vírus esetén alkalmazhatjuk, de ugyanúgy alkalmas ez bármely vírusos bőrkiütéses betegség esetén. A vakcinázási eljárás abban áll, hogy valamely fogékony szervezetbe hideg úton, előnyösen intradermálisan, például oltással beadjuk a bőrkiütéses megbetegedést kiváltó vírus hőre érzékeny és lényegében nem patogén mutáns törzsének a hatásos adagját. A bőrkiütéses megbetegedések példái a himlő, az ember himlővel kapcsolatos vírusos fertőzései, tehénhimlő, bárányhimlő, övsömör, kanyaró, rubeóla, Herpes simplex és Herpes B. vírus által kiváltott fertőzések. Azt találtuk, hogy ha az oltásnak ezt a fajtáját választjuk, a vírus vakcina növekedése csak a test hideg területeire korlátozódik és a védelem bekövetkezik kimutatható keringő szérum-neutralizáló ellenanyagok távollétében. Ennek ellenére a teljes vak cinázott szervezet védve van, ezzel a vakcinázási módszerrel. Meglepődve tapasztaltuk, hogy az ilyen intradermális vakcinázás megvédi a vakcinázott szervezetet a perifériális idegpályán a perifériától a központ felé haladó újrafertőződéstől vagy egy teljesen eltérő és az említett szervezet melegebb részén, így például az agyban bekövetkező újrafertőződéstől. A találmány szerinti eljárásban a 2. szerotípusú Herpes simplex bőrre érzékeny mutáns törzsének az előállítására, amelyet vakcina előállítására használhatunk fel, kiindulási anyagként klinikai esetből elkülönített 2. szerotípusú Herpes simplex törzset vagy szövetkultúrában sorozatos passzálás végén kapott 2. szerotípusú Herpes simplex vírus törzset használhatunk fel, szövetkultúraként például elsődleges nyúl vese sejteket használhatunk. A találmány értelmében a 2. szerotípusú Herpes simplex vírus hőre érzékeny és nem patogén törzsét úgy állítjuk elő valamely 2. szerotípusú Herpes simplex patogén vírus törzséből, hogy az említett 2. szerotípusú patogén Herpes simplex törzset, előnyösen az NRRL 5704 szám alatt letétbe helyezett ilyen törzset 4 és 5 közötti pH-értéken érintkezésbe hozzuk salétromossav pufferolt vizes oldatával és az így kapott hőre érzékeny mutáns törzset elkülönítjük. A salétromossav pufferolt vizes oldata előnyösen ecetsav-pufferrel készített salétromossav, a salétromossav és az acetát-ion koncentrációja a reakcióközegben n és n/4, a törzset 1-15 percen át hagyjuk érintkezésben a salétromossav-oldattal, előnyösen 3 percen át (±1) 4,6 (±0,1) pH-értéken, 5 szobahőmérsékleten és ezután 8 (± 1) percen át 4,2 (±0,1) pH-értéken, szobahőmérsékleten. Az így kapott hőre érzékeny mutáns törzset ezután úgy különítjük el, hogy legalább egyszer kiónozzuk olyan szövetkultúrában, amely az iro-10 dalom szerint megfelelő a 2. szerotípusú Herpes simplex vírus növekedése szempontjából és megfelelő szubsztrátum vakcina előállításához, amilyen például a csirkeembrió fibroblaszt, humánembrió fibroblaszt vagy elsődleges nyúlvese sejtkultúra. így 15 például a törzset kétszer kiónozzuk olyan elsődleges nyúlvese (PRK) szövetkultúrában, amely specifikus patogénmentes (SPF) kolóniából származik, hat napos inkubációs periódus után 30 C° és 37 C° (± 1 C°) közötti hőmérsékleten például 35 C°-on. 20 A találmány értelmében úgy állítjuk elő a vakcinát, hogy a 2. szerotípusú Herpes simplex vírus fenti módon kapott hőre érzékeny mutáns törzsét elsődleges nyúlvese sejtkultúrába inokuláljuk 37 C° (± 1 C°) alatti hőmérsékleten, előnyösen 35 C°-on 25 (± 1 C°), majd annyi ideig inkubáljuk, amely elegendő ahhoz, hogy nagy mennyiségű vírus fejlődjék ki és a keletkező vírusokat learatjuk. Az így kapott 2. szerotípusú Herpes simplex vírus vakcinát hideg úton, előnyösen intradermá-30 lisan adjuk be valamely, a fogékony szervezetnek megfelelő adagban, így például legalább 103 TCIDso adagban (TCIDS0

: a szövetkultúrát 50%-ban megfertőző adag). Vakcinázási célra a vírust előnyösen fagyasztva 35 szárított alakban tartjuk és a vakcinát felhasználás előtt feloldjuk víz vagy bármilyen egyéb gyógyászatilag elfogadható olyan hígítószer vagy készítmény hozzáadásával, amely parenterális készítmények elkészítésére ismert az irodalomból. 40 A találmány szemléltetésére az alábbi példákat adjuk meg, ahol kiindulási anyagként 2, szerotípusú Herpes simplex vírus törzset alkalmaztunk, amelynek jelzése a bejelentő gyűjteményében „Herpes 2 parental" (deponálási száma NRRL 5704). A „Her-45 pes 2 parental" törzsből kapott két hőre érzékeny, 2. szerotípusú Herpes simplex mutáns törzset „Herpes 2 ts 1" és „Herpes 2 42082" jelzéssel jelöltük (deponálási számuk NRRL 5705 és 5706). A hőre érzékeny mutáns törzs előállítási eljárását, valamint 50 az abból kapott vakcinának az előállítási eljárását természetesen bármely más 2. szerotípusú Herpes simplex vírus törzs esetén is alkalmazhatjuk. 1. példa 55 Elsődleges nyúlvese sejtkultúrákat állítunk elő 3—5 hetes nyulak veséjéből, amelyek specifikus patogénmentes kolóniából származnak - mely közelebbről egy olyan nyúl kolóniát jelent, mely men-60 tes a Herpes cuniculi vírustól, a nyúlvese vakuoláló vírustól, nyúl syncitialis vírustól, az 1,2,3 és 5 emberi parainfluenza vírusoktól, az 1, 2 és 3 emberi reovírusoktól, az emberi adenovírusoktól, a Toxoplasma és encephalitozoon cuniculitól vagy 65 jelenthet bármely más, ezekkel összemérhető spe-2