169253. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2. szerotipusú Herpes simplex élő vírusvakcina előállítására
169253 5 6 cifíkus patogénmentes nyúl kolóniát, melyet az ezen a területen átlagos tudással rendelkező szakemberek általában használnak - tenyészközegként 0,5% laktalbumin-hidrolizátummal és 10% borjúszérummal kiegészített Hank-oldatot alkalmazva. „Herpes 2 parental" jelzésű vad, NRRL 5704 deponálási számú 2. szerotípusú Herpes simplex vírus törzset kétszer passzálunk a fenti elsődleges nyúlvese szövetkultúrákban fenntartó közegként 2% 7-glubulin nélküli borjúszérummal kiegészített Eagle-közeget (gyártja HYLAND TRAVENOL Labs., Los Angeles, California, USA) használva és az utolsó passzázs felülúszó részét learatjuk. így milliliterenként 105,s TCID 50 vírust tartalmazó szuszpenziót kapunk. Ennek a vírus szuszpenziónak 1 ml-ét összekeverjük 0,5 ml 4 mólos vizes nátriumnitrit-oldattal 0,5 ml M ecetsav/nátriumacetát pufferben (melyet úgy készítünk, hogy 6g jégecetet 100ml-re kiegészítünk desztillált vízzel és 13,6 g nátriumacetát 100 ml desztillált vízzel készített oldatának 3 térfogatrészével, miután mindkét oldatot 30 percen át sterilizáljuk 121 C°-on), a végső pH-érték 4,6. Az elegyet 3 percen át reagáltatjuk szobahőmérsékleten, majd a reakciót n nátriumhidroxid-oldat cseppenkénti adagolásával megállítjuk, miközben az elegyet keverjük és az adagolás 7,5 (± 0,5) pH-érték eléréséig folytatjuk. A pH beállítását a vírus szuszpenzióhoz adott fenolvörös indikátor színének változásával követjük. A közeget azonnal dializáljuk 5 órán át +4 C°-on (±1) sós foszfát-pufferral szemben (ez 8g nátriumkloridot 0,2 g káliumkloridot, 1,15 g dinátriumhidrogénfoszfátot és 0,2 g káliumdihidrogénfoszfátot tartalmaz, amelyeket 800 ml desztillált vízben oldottunk és ezt az oldatot összekevertük MgCl2 '6H 2 0 100 ml desztillált vízzel készített oldatával, majd 0,1 g kalciumklorid 100 ml desztillált vízzel elkészített oldatával, a végső oldatot szűréssel sterilizáltuk, a végső pH 7,2 és 7,4 közötti). Ez utóbbit többször megújítjuk, a nitrit anion eltűnéséig. A minta egy részét titráljuk és a fennmaradó részt —70 C°-on tároljuk. A titrálást cső-véghígításos módszerrel végezzük elsődleges nyúlvese szövetkultúrában végzett 7 napos inkubálás után a kikapcsoló hőmérsékleten (38,5 C° ± 1 C°), hígításonként két csövet használva. (Kikapcsoló hőmérséklet az a hőmérséklet-tartomány, amelyben a hőre érzékeny törzs szaporodása jelentősen gátolt, míg a vad törzsek szaporodása változatlan marad.) A -70C°-on tárolt mintát felhígítjuk oly módon, hogy az 0,2 ml-ként 1 TCID50 vírust tartalmazzon. Ezzel a hígított mintával inokulálunk 24 elsődleges nyúlvese sejtkultúrát tartalmazó csövet, csövenként 0,1 ml inokulumot használva. A csöveket megengedett hőmérsékleten inkubáljuk (35 C°/± 1 C°), ahol a megengedett hőmérséklet az a hőmérséklet-tartomány, amelyben mind a vad, mind a hőre érzékeny törzs képes szaporodni. Négy és tíz nap közé eső különböző hosszúságú inkubációs periódusok után 16 inokulált cső mutat tipikus Herpes citopatogén hatást, ezeket a csöveket l-l6-ig megjelöljük és -70C°-on tároljuk. Ennek a 16 pozitív mintának a párhuzamos titrálását a megengedett hőmérsékleten (35 C°) és a kikapcsoló hőmérsékleten (39 C°) végezzük. Azokat a mintákat, amelyeknek titere jelentősen eltér a megengedett és kikapcsoló hőmérsékleten, tovább 5 kiónozzuk véghígításos passzálással. így összegyűjtve a 4. számú minta 10~4 hígításának pozitív csöveit (azaz az 5 napon át inkubált minta pozitív csöveit), „Herpes 2 tsl", NRRL 5705 deponálási számú törzs szuszpenzióját kapjuk. 10 A citopatogén hatást a Tischendorf P. és munkatársai által leírt módszer szerint határozzuk meg [Zentral. Bakt., Paras.-, Infekt, und Hyg. 204, 1-15. oldal, (1967.)]. Az 1. példában kapott „Herpes 2 ts 1" NRRL 15 5705 deponálási számú vírus törzset egyszer passzáljuk elsődleges nyúlvese szövetkultúrákban és a felül úszó rétegeket learatjuk, így milliliterenként 105 ' 3 TCIDso vírust tartalmazó szuszpenziót kapunk. 20 Ennek a vírus szuszpenziónak 1 ml-ét összekeverjük 0,5 ml 4 mólos vizes nátriumnitrit-oldattal 0,5 ml M ecetsav/nátriumacetát pufferben (amelyet úgy készítünk, hogy 6g jégecetet 100ml-re kiegészítünk desztillált vízzel és 13,6 g nátriumacetát 25 100 ml desztillált vízzel készített oldatának 3 térfogatrészével, mindkét oldatot 30 percen át sterilizálva 121 C°-on), a végső pH-érték 4,2. Az elegyet 8 percen át reagáltatjuk szobahőmérsékleten, majd a reakciót n nátriumhidroxid-oldat 30 cseppenkénti adagolásával megállítjuk, miközben az elegyet keverjük és az adagolást 7,5 (± 0,5) pH-érték eléréséig folytatjuk. A pH-beállítását a vírus szuszpenzióhoz adott fenolvörös indikátor színének változásával követjük. 35 A közeget azonnal dializáljuk +4 (± 1) C°-on sós foszfát pufferral szemben (amely 8 g nátriumkloridból, 0,2 g káliumkloridból, 1,15 g dinátriumhidrogénfoszfátból és 0,2 g káliumdihidrogénfoszfátból áll, amelyeket desztillált vízzel 800 ml-re 40 egészítettünk ki, ezt az oldatot összekevertük MgCl2 -6H 2 0 100 ml desztillált vízzel készített oldatával, majd 0,1 g kalciumklorid 100 ml desztillált vízzel készített oldatával, a végső oldatot szűréssel sterilizáltuk, mimellett a végső pH 7,2 és 45 7,4 közötti). Ez utóbbit többször megújítjuk a nitrit-anion eltűnéséig. A minta egy részét titráljuk és a fennmaradó részt —70 C°-on tároljuk. A titrálást cső-véghígításos módszerrel végezzük elsődleges nyúlvese szövetkultúrában végzett 7 napos inkubá-50 lás után a kikapcsoló hőmérsékleten (38 C° ± 1 C°), hígításonként két csövet használva. A -70 C°-on tárolt mintát felhígítjuk oly módon, hogy 0,2 ml-ként 1 TCIDS0 vírust tartalmazzon. Ezzel a hígított mintával inokulálunk 17 55 elsődleges nyúlvese szövetkultúrát tartalmazó csövet csövenként 0,1 ml inokulumot használva. A csöveket a megengedett hőmérsékleten inkubáljuk (35 C° ± 1 C°). Négy és tíz nap közé eső különböző hosszúságú inkubációs periódusok után 12 60 inokulált cső mutat tipikus Herpes citopatogén hatást, ezeket a csöveket 1—12-ig megjelöljük és —70C°-on tároljuk. Ennek a 12 pozitív mintának a párhuzamos titrálását a megengedett hőmérsékleten (35 C°) és a kikapcsoló hőmérsékleten 65 (39 C°) végezzük. Azokat a mintákat, amelyeknek 3
