169171. lajstromszámú szabadalom • Elljárás és reagens koleszetrin meghatározására
3 169171 4 jelenti, amely abból áll, hogy koleszterint vizes közegben koleszterinoxidázzal előnyösen Proactinomyces fermentációval előállított koleszterinoxidázzal inkubálunk és az oxigénfogyasztást, vagy a képződött H2 0 2 -t, illetőleg kolesztenont határozzuk meg. A koleszterinoxidáz a következő reakciót katalizálja: koleszterinoxidáz Koleszterin + 02 kolesztenon + + H2 0 2 A fenti reakció kvantitatívan megy végbe és ezért a koleszterin abszolút specifikus és pontos mennyiségi meghatározását teszi lehetővé. A találmány szerinti eljárás alkalmas koleszterin meghatározására mindenfajta vizes közegben, így élelmiszer-kivonatokban, testnedvekben és különösen szérumban. Az eljárás nagy specificitása miatt csak a szabad koleszterin határozható meg. A kötött formában levő, azaz észterezett koleszterin is meghatározható azonban előzetes kémiai vagy enzimatikus elszappanosítás után. A kémiai elszappanosítási például alkoholos káliumhidroxiddal, az enzimatikus elszappanosítási koleszterin észterázzal, előnyösen máj- vagy pankreász-koleszterinészterázzal végezhetjük el. A fenti egyenlet szerinti oxigénfogyasztás, H2 0 2 -képződés vagy kolesztenon-képződés mérése ismert és szokásos módszerekkel történhet. Alkalmas módszer az oxigénfogyasztás mérésére például a gázkromatográfia és a polarográfia. Előnyben részesítjük az oxigéneiektródos polarometriás meghatározást, mivel ez az eljárás különösen alkalmas a koleszterinmeghatározás automatizált végrehajtására. Ismeretesek ilyenfajta meghatározási módszerek. Különösen alkalmasnak bizonyultak a 2 130 340 2 és 2 130 308 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli közrebocsájtási iratban leírt módszerek az oxigénfogyasztás vizes közegben való polarometrikus""mérésére. A képződött H2 0 2 -ot mind titrimetriásan, mind polarometrikusan, kolorimetrikusan ül. enzimatikusan meghatározhatjuk. Előnyben részesítjük az enzimatikus módszereket peroxidáz vagy kataláz használatával, minthogy e módszerek nemcsak rendkívül specifikusak és megbízhatók, hanem a H2 0 2 -képződés folytán a főreakcióval igen egyszerűen kombinálhatók. Különösen alkalmasnak bizonyult a katalázzal történő meghatározás beta-diketonok, mint például acetil-aceton és egy kis szénatomszámú alifás egy- vagy többértékű alkohol, mint metanol, etanol vagy metilénglikol jelenlétében, valamint a peroxidázzal való meghatározás egy kromogén jelenlétében. Katalázzal, acetilacetonnal és metanollal történő meghatározásnál az utóbbi formaldehiddé oxidálódik, amely acetil-acetonnal mérhető színreakciót ad. Peroxidázzal való meghatározásnál kromogénként olyan vegyületeket használunk, amelyek a reakció után fotometrikusan meghatározhatók. Alkalmas kromogén például 2,2'-amino-benztiazolin-szulfonsav. A kolesztenon meghatározása ketoreagensek segítségével történik, előnyösen ketocsoportokkal hidrazont képező hidrazin-származékokkal, mint például (2,4-dinitro-fenil)-hidrazinnal. A kolesztenont 5 azonban közvetlenül is meghatározhatjuk 240 nmnél történő abszorpcióméréssel. A találmány tárgyát ezenfelül koleszterinmeghatározásra szolgáló reagens képezi, amely kolesz-10 terinoxidázból és H2 0 2 -meghatározásra alkalmas rendszerből vagy kolesztenon-meghatározásra alkalmas rendszerből áll. Egy előnyben^ részesített kivitelezési formánál ez a reagens koleszterinoxidázból, katalázból, acetil-acetonból, metanolból, ara-15 móniumion-tartalmú pufferből áll, külön vagy elegyítve. Egy további előnyben részesített kivitelezési formánál a reagens koleszterinoxidázból, peroxidázból, kromogénből és pufferből áll, külön vagy elegyítve. Kromogénként előnyösen 2,2'-amino-20 -benztiazoíin-szulfonsavat használunk. Egy további előnyben részesített kivitelezési forma szerint a találmány szerinti reagens koleszterinoxidázból és ketocsoportokkal hidrazonképződés közben reagáló hidrazin-származékból, valamint 25 adott esetben pufferből áll. Hidrazin-származekként (2,4-dinitrofenil)-hidrazint részesítjük előnyben. A fent említett előnyben részesített reagenskombinációk a felsorolt szükséges alkotórészeken 30 kívül előnyösen még szokásos oldószereket, stabilizátorokat és felületaktív anyagokat tartalmaznak. Ezek az adalékanyagok a szakemberek előtt ismertek és szokásosak a H2 0 2 -ot, illetve kolesztenont kimutató rendszerekben. 35 A fent említett reagenskombinációk az esszenciális alkotórészeket előnyösen a következő menynyiségi arányokban tartalmazzák: 1. 13-150 E koleszterinoxidáz, valamint 40 2 • 104 —5 • 10 s E szokásos minőségű kataláz, 0,05-0,2 ml acetil-aceton, 2-10 ml metanol 100 ml 5—7 pH-jú ammóniumion-tartalmú pufferben, valamint 0,02—0,3 ml felületaktív szer (előnyösen hidroxi-polietoxi-dodekán). 45 2. 3-40 E koleszterinoxidáz, valamint 2 • 102 --1 • 104 E kereskedelmi peroxidáz, 50-200 mg 2,2'-amino-benztiazolin-szulfonsav, valamint 0,05-0,5 ml felületaktív szer 100 ml 6-8 pH-jú pufferben. 50 3. 0,1—1 E koleszterinoxidáz, 1-5 ml 1 mM (2,4-dinitro-fenil)-hidrazin-oldat és adott esetben 0,005-0,1 ml felületaktív szer. 4. 2—100 E koleszterinoxidáz, valamint 0,1-2,0 ml felületaktív szer (előnyösen hidroxi-S5 -olietoxi-dodekán) 50 ml 5-9 pH-jú puff erben, előnyösen 7,5 pH-jú nátrium-foszfát pufferben. A koleszterinoxidáz kereskedelmi készítmény, a Boehringer Manheim GmbH gyártmánya. Kolesz-60 terinoxidáz például a következőképpen állítható elő: 20 literes fermentorban 15 liter táptalajt -amely 0,5 súly% ammónium-acetát, 0,05 súly% 65 szekunder kálium-foszfát, 0,2 súly% primer amraó-2
