169171. lajstromszámú szabadalom • Elljárás és reagens koleszetrin meghatározására
169171 , 5 o nium-foszfát, 0,02 súly% magnéziumszulfát-heptahidrát, nyomnyi mennyiségű vas-klorid és kálium-klorid csapvizes oldata - beoltunk 0,5 liter jól kifejlett Proactinomyces erythropolis NBIC 9158 előtenyészettel és a mikroorganizmust erőteljes levegőztetés mellett tenyésztjük (600 liter levegő/óra, keverési fordulatszám 600 fordulat/perc, a keverő lapátátmérője 120 mm). A tenyészet pH-ját 20%-os ecetsav folyamatos hozzáadásával állandó értéken tartjuk, az ecetsav-hozzáadást addig folytatjuk, amíg a biomassza töménysége körülbelül 1,5 g/liter lesz, ami 1 :20 hígítású tápfolyadéknál E = 0,250 értékű zavarosságnak felel meg. A fenti koncentráció elérése után sterilezett koleszterinszuszpenziót adunk hozzá folyamatosan a további tenyésztés alatt, oly módon, hogy 20 órás tenyésztési időn belül összesen 30 g koleszterint viszünk be a fermentorba. A koleszterin-szuszpenzió 0,1-0,2% élesztőkivonatot tartalmaz. A tenyészet semlegesítésére ecetsav helyett most már hígított sósavat használunk. A tenyésztést befejezve a biomasszát centrifugálással választjuk el a tápoldattól és 2,6 g/liter szárazanyagot kapunk, melynek aktivitása 12 E/g szárazanyag. Előállíthatunk koleszterinoxidázt a fenti eljárást követve, például Nocardia spec. ATCC 14558 vagy ATCC 12288 törzsekkel is. Ily módon 5g illetve 35 g biomasszát kapunk, 2 illetve 5 E/g szárazanyag aktivitással. A következő példák a találmány további megvilágítására szolgálnak. 1. példa Az oxigénfogyasztás polarometrikus meghatározása Az 1. ábrán látható készüléket használjuk. A készülék 1 reaktorból áll, mely áttetsző műanyagból álló, 143 mm belső átmérőjű és 220 mm belmagasságú henger alakú kamra. A kamrába 1,8 ml 6,0 pH-jú 0,2 M kálium-foszfát-puffert töltünk, amely 18 mM kálium-jodidot, 7,5 mM ammónium-heptamolibdenátot, 80 mM nátrium-kloridot és 2 E koleszterinoxidázt (gyártja: Boehringer Manheim GmbH) tartalmaz. A reaktorba benyúlik a 3 detektor, amely oxigén-érzékeny elektródból áll (WTW: OXI-elektrőd E016). A detektor a 4 analizátorral van összekötve (WTW: digitális mérőműszer DIGI610, OX1610 D toldalékkal). Az 1 reaktor feneként az 5 mágneses keverő található. A 6 töltőnyíláson keresztül 20 ßl koleszterintartalmú vizes mintaoldatot mérünk be. A mágneses keverővel erőteljesen keverve megmérjük az oldat oxigéntartalmának a fogyását, az értékek közvetlenül leolvashatók a mérőműszer skáláján. A 2,5 perc reakció után megfigyelt oxigénfogyasztást a koleszterinkoncentrációval szemben ábrázoljuk. A koleszterintartalmú oldat különböző koncentrációira kapott mérési eredmények a 2. ábra rajzán láthatók. Ez a mért értékek és a kolesztrinkoncentráció közötti lineáris összefüggést mutatia. Az eljárást megismételjük alkoholos káliumhidroxiddal elszappanosított szérummintával. A meghatározás 193 mg koleszterin/100 ml koncentrációt ad. A Liebermann-Burchard reakcióval ka-5 pott összehasonlító érték 182 mg/100 ml. 2. példa 10 H2 0 2 meghatározása 10 g ammónium-hidrogén-foszfátot feloldunk 100 ml vízben és 85%-os foszforsawal a pH-t 7,0-re állítjuk be. Ezután hozzáadunk 105 E kata-15 lázt. A kapott oldattal 0,2 ml acetil-aceton és 10 ml metanol elegyét 100 ml-re töltjük fel. Az így kapott oldat 7,5 ml-éhez 0,5 ml szérumot, illetve 0,5 ml koleszterin standard oldatot 20 adunk, mely utóbbi 200 mg% koleszterint tartalmaz. A szérumot tartalmazó minta, valamint a koleszterin-standardot tartalmazó minta aliquotjaihoz 5 E koleszterinoxidázt és 0,02 ml 10%-os hidroxi-polietoxi-dekán(gyártó: Merck)-oldatot 25 adunk és a rendszert 70 percig 37 C°-on inkubáljuk. Ezután a képződött szint 405 nm-nél fotometrikusan lemérjük, tekintetbe véve a reagensek vakértékét. A koleszterin standard oldattal kalibrációs görbét veszünk fel, amelyet a 3. ábra rajzán 30 láthatunk. A kalibrációs görbén a koleszterinkoncentrációt a 405 nm-nél mért extinkcióval szemben ábrázoljuk. A szérumtartalmú minta koleszterintartalmának 35 meghatározásához standardot használunk vonatkozási mennyiségként. A Liebermann-Burchard reakcióval végzett kontroli-meghatározások 5% eltérést adnak. 3. példa H2 0 2 meghatározása 45 3 ml 7 pH-jú (oxigénnel telített), 100 mg% 2,2'-amino-benztiazolin-szulfonsavat tartalmazó kálium-foszfát-pufférhez hozzáadunk 0,05 ml 20%-os hidroxi-polietoxi-dekánt és 0,02 ml (= 36 E) kereskedelmi peroxidáz-oldatot, (Boehringer-Mannheim) va-50 lamint 0,02 ml H2 0 2 -ot (0,02 ml 30%-os H 2 0 2 100 ml vízre), a redukáló anyagok eltávolítása céljából. A reakciót fotométerrel 405, vagy 436 nm-nél követjük. A reakció leállása után hozzáadunk 0,01 ml szérumot (vízzel 1 : 15-re hí-55 gítva). 10 perc múlva hozzáadunk 0,15 E koleszterinoxidázt. További 10 perc múlva az extinkciókülönbséget leolvassuk. Hasonló módon, de 200 mg% koleszterint tartal-60 mázó standard oldattal felvesszük a 4. ábrán látható kalibrációs görbét. Ezen görbe segítségével meghatározzuk a szérumminta koleszterintartalmát. A mérés 180 mg% koleszterint ad. Liebermann-Burchard reakcióval végzett kontrollméréssel 55 185 mg%-ot kapunk. 3
