169161. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükozidhidroláz inhibitorok előállítására az Actinomycetales rendbe tartozó törzsekkel
3 169161 4 lkg lisztből az ismert eljárással 10 g 160 000AIE/g aktivitású inhititort kapunk, össz-aktivitás: 1,6- 106 AIE, 1 kg sikerből az ismert eljárással 18 g 775 000 AIE/g aktivitású inhibitort kapunk, össz-aktivitás: 14 • 106 AIE, 1 liter fermentléből leírásunk 38. példája szerint 3,1 g 8 • 106 AIE/g aktivitású inhibitort kapunk, össz-aktivitás: 24,5 • 106 AIE. Emellett 1 liter fermentlé technikai előállítási költsége lényegesen alacsonyabb, mint 1 kg lisztté illetőleg 1 kg sikeré. A kétféle módon előállított inhibitor in vivo hatásának összehasonlítására patkányokon végzett kísérleteink során kitűnt, hogy a búzából előállított inhibitort körülbelül tízszeres koncentrációban kell alkalmazni, hogy ugyanolyan mértékű vér-glükóztartalom csökkenést érjünk el, mint a jelen találmány szerinti mikrobiológiai eljárással előállított inhibitorral. A találmány tárgyát tehát új eljárás képezi glükozidhidroláz inhibitoroknak, különösen az emésztőrendszer szénhidráthasító enzimjeit gátló inhibitoroknak, főként amiláz-, maltáz-, vagy szacharáz-inhibitoroknak, illetőleg ezek két- vagy háromkomponensű keverékeinek az előállítására, az Actinomycetales rendbe tartozó mikroorganizmus-törzsek tenyésztése és a képződött inhibitornak a fermentléből való elkülönítése útján. Az említett inhibitorokat különösen az Actinomycetales rend mikroorganizmusai, különösen a Streptomycetaceae, Thermoactinomycetaceae, Micromonosporaceae családokba tartozó mikroorganizmusok képezik. Küönösen nagy mennyiségben termelik az Actinoplanes, Ampullariella, Streptosporangium, Streptomyces, Chainia, Pilimelia, Planomonospora és Actinobifida genusba tartozó törzsek. (Alkalmazott rendszertan: Sykes G. és Skinner F. A.: Actinomycetales: Characteristics and practical importance, 1973. Academic Press, London, New York.) A hatásos törzseket az alábbiakban ismertetett módszerekkel találtuk meg. Talajpróbákból ismert módon izoláljuk az Actinomycetales rendbe, különösen a Streptomycetaceae és Actinoplanaceae családokba tartozó törzseket vagy pedig törzs-gyűjteményekből vásároljuk meg ezeket a törzseket. Ezeknek a törzseknek az átoltásával beoltjuk az olyan táptalajokat tartalmazó tenyészlombikokat, amely táptalajok lehetővé teszik ezeknek a törzseknek a növekedését. Használhatunk például olyan Plotho-féle glicerin-glikokoll-táptalajt, amelynek az összetétele: 2%g glicerin, 0,25% glikokoll, 0,1% NaCl, 0,1% K2 HP0 4 , 0,01% FeS0 4 -7H 2 0, 0,01% MgS04 -7H 2 0 és 0,01% CaC0 3 . Gyorsabb növekedés érdekében az ilyen táptalajhoz célszerűen még komplex szénforrásokat adunk, így például kukoricalekvárt szójalisztet élesztőextraktumot vagy proteinhidralizátumokat, például NZ-aminokat vagy ezeknek az anyagoknak a keverékeit. Ezekben az esetekben a táptalaj pH-értékét be kell állítani. A táptalaj kezdeti pH-értéke előnyösen 6,0 és 8,0 közötti, különösen 6,5 és 7,5 közötti. A táptalaj glicerintartalmát egyéb szénforrások-5 kai is helyettesíthetjük, így például glükózzal, nyerscukorral vagy keményítővel vagy ezeknek az anyagoknak a keverékeivel. Glikokoll helyett egyéb nitrogénforrásokat is használhatunk, így például élesztőextraktumot, szójalisztet, NZ-aminokat stb. 10 A szén- és nitrogénforrások koncentrációját, valamint a sók koncentrációját széles határokon belül változtathatjuk. Az FeS04 , CaC0 3 és MgS0 4 teljesen hiányozhatnak is. A táptalajnak körülbelül 100-200 ml mennyiségét 1 literes Erlenmeyer-lom-15 bikba töltjük, ismert módon sterilizáljuk, beoltjuk a vizsgálandó törzzsel és a lombik tartalmát 15-60 C°-on előnyösen 24-50 C°-on rázógépen tenyésztjük. Ha növekedést tapasztalunk ez általában 1-10 nap múlva, többnyire 3-5 nap múlva 20 következik be), körülbelül 5 ml-es mintát veszünk és ebben a mintában a micéliumot szűréssel vagy centrifugálással elválasztjuk. A tenyész szűrlet 0— 100 Atl-ét használjuk fel az alábbiakban ismertetett próbákban és kiszámítjuk 1 ml szűr let gátló 25 kapacitását. A micéliumokat micéliumtérfogatra számított 2x5 térfogatrész acetonnal és ezt követően 1x5 térfogatrész dietiléterrel extraháljuk, az extrahált micélium maradékot vákuumban 20C°-on szárítjuk 30 és a kapott száraz micélium port 4—8 súlyrész dimetilszulfoxiddal (DMSO) extraháljuk. A két acetonos extraktumot és az éteres extraktumot egyesítjük és vákuumban csaknem szárazra pároljuk. Ezeknek az extraktumoknak a 35 maradékát felvesszük a száraz por DMSO-extraktumával és ennek 0—100 ßl mennyiségét használjuk fel az alábbiakban ismertetett próbákhoz. Amiláz-próba 40 Egy amiláz-inhibitor egység (1 AIE) az az inhibitor mennyiség, amely két amiláz-egységet 50%-ig gátol. Egy amiláz-egység (AE) az az enzimmennyiség, amely 1 perc alatt a megadott 45 kísérleti körülmények között 1 p egyenérték glükozid-kötést hasít fel keményítőben. A //Val lehasított kötéseket mint //Val képződött redukálócukrot dinitroszalicilsavval határozzuk meg kolorimetriásan és maltóz kalibrációs görbe segítségével 50 mint juVal maltóz-egyenértékeket adjuk meg. A kísérlet megvalósításakor 0,1 ml amiláz-oldatot (20-22 AE/ml) összekeverünk 0-40Ö jug inhibitorral vagy a vizsgálandó tenyészoldat, illetve micéliumextraktum 0-100/il-ével 0,4 ml 0,02 m 55 nátriumgl; jerofoszfátpuffer (0,001 m CaCl 2 -ben pH = 6,9 értéken és körülbelül 10-20 percen keresztül vízfürdőn 35 C°-on egyensúlyban tartjuk. Ezután 5 percen keresztül 35 C°-on inkubáljuk 0,5 ml 35 C°-ra melegített 1%-os keményítő-oldattal 60 (oldható keményítő, gyártja Merck, Darmstadt, Nr. 1252) és ezt követően összekeverjük 1 ml dinitroszalicilsav-reagenssel [P. Bernfeld Colowick-Kaplan, Meth. Enzymol. c. könyvében, Band 1, (149)]. A szín kifejlesztése céljából az elegyet 65 5 percen keresztül forrásban levő vízfürdőn melegít-2
