169161. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükozidhidroláz inhibitorok előállítására az Actinomycetales rendbe tartozó törzsekkel
5 169161 6 jük, majd lehűtjük és 10 ml desztillált vízzel összekeverjük. Az extinkciót 540 rrp-on mérjük megfelelő amiláz nélküli vakpróbával szemben. Kiértékelés céljából egy előzőleg felvett amiláz kalibrációs görbéből leolvassuk az inhibitor hozzá- 5 adása után még hatásos amiláz aktivitást és ebből kiszámítjuk a beadagolt amiláz %-os gátlását. A %-os gátlást a Mg inhibitor + 10 AE++ hányados függvényeként visszük fel, az 50%-os gátlás pontját leolvassuk a görbéből és átszámítjuk 15 AIE/mg inhibitor értékre. A fenti hányadosban + jelentése: szárazanyagra számítva és ++ jelentése: amiláz egység ugyanannak a sorozatnak a nem gátolt részében. 20 Szacharáz próba Egy szacharáz-inhibitor-egység (SIE) az az inhibitor mennyiség, amely két szacharáz-egységet 50%-ig gátol. Egy szacharáz egység (SE) az az 25 enzimmennyiség, amely 1 perc alatt a megadott kísérleti körülmények között 1 jumól szacharózt glükózra és fruktózra hasít. A jumól hasított szacharózt a képződött glükóz és fruktóz mennyisége alapján dinitroszalicilsawal kolorimetriásan 30 határozzuk meg és glükóz/fruktóz kalibrációs görbe segítségével értékeljük ki. A kísérlet megvalósításakor 0,1 ml szacharáz oldatot [disznóbél mucosa-ból származó oldott 35 szacharáz B. Borgström és A. Dahlquist szerint: Acta Chem. Scand. 12, (1958) 1997. oldal] (0,3-0,4 SE/ml) 0,1 ml 0,1 mólos Na-maleinátpufferben pH = 6,0 értéken összekeverünk 0—400 jug inhibitorral illetve a micélium extraktum vizsga- 40 landó tenyészoldatának 0—50 jul-ével és körülbelül 10-20 percen keresztül 35 C°-os vízfürdőn tartjuk. Ezután 60 percen keresztül 35 C°-on inkubáljuk 35 C°-ra előmelegített 0,056 mól szacharóz oldat (Saccharose Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 7652) 45 0,2 ml-ével, majd összekeverjük 0,5 ml dinitroszalicilsav-reagenssel (P. Bernfeld szerint, Colowick-Kaplan, Meth. Enzymol, 1. kötet, 149. oldal). A szín kifejlesztése céljából az elegyet 5 percen keresztül forrásban levő vízfürdőn melegítjük, majd lehűtjük 50 és összekeverjük 5 ml desztillált vízzel. Az extinkciót 540 mju-on mérjük, megfelelő, szacharáz nélküli vakpróbával szemben. Kiértékelés céljából az inhibitor adagolása után még hatásos szacharáz egységeket kalibrációs görbéből határozzuk meg és 55 ebből kiszámítjuk a beadagolt szacharáz %-os gátlását. A %-os gátlást a iug inhibitor + SE++ hányados függvényeként visszük fel, az 50%-os gátlás pontját leolvassuk a görbéről és átszámítjuk SIE/mg inhibitor értékre. A fenti hányadosban + 65 jelentése: szárazanyagra számítva és ++ jelentése: szacharáz egység ugyanannak a sorozatnak a nem gátolt részében. Maltáz próba Egy maltáz-inhibitor-egység (MIE) az az inhibitor mennyiség, amely két maltázegységet 50%-ig gátol. Egy maltáz egység (ME) az az enzimmennyiség, amely 1 perc alatt az alábbiakban megadott kísérleti körülmények között a p-nitrofenil-a-D^lükopiranozidban 1 ß egyenérték glükozid-kötést hasít fel. A juVal hasított kötést fotometriásan határozzuk meg, mint //Val p-nitrofenolátot. A kísérlet megvalósításakor 0,05 ml maltáz oldatot [disznóbél mucosa-ból származó oldott maltáz B. Borgström és A. Dahlquist szerint: Acta Chem. Scand. 12, (1958) 1997. oldal, vagy humán pankreásznedv liofilizátum alakjában levő maltáz] (0,09-0,12 ME/ml) 0,05 ml 0,1 mólos Na-maleinátpuff erben pH = 6,0 értéken körülbelül 10-20 percen keresztül 35 C°os vízfürdőn tartunk 0-400 pg inhibitorral, ill. a micélium extraktum, ill. a vizsgálandó tenyészoldat 0-20/i-ével. Ezután 30 percen keresztül 35 C°-on inkubáljuk 0,1 mólos Na-maleinátpufferben pH=6 értéken 35 C°-ra előmelegített, 0,4%-os p-nitrofenil-a-D-glükopiranozid-oldat 0,1 ml-ével (Fa. Serva, Heidelberg, Nr. 30716) és ezt követően a reakciót 2 ml, 0,565 mólos, 7,6 pH-értékű trisz-puffer hozzáadásával megállítjuk. Az extinkciót azonnal lemérjük 403 m/x-on megfelelő, maltáz nélküli vakpróbával szemben. Kiértékelés céljából a p-nitrofenolát anion számára 7,6 pH-értéken megadott E403 = 13,2 x 103 moláris extinkciós koefficiens alapján kiszámítjuk az inhibitor hozzáadása után még hatásos maltáz egységeket és abból a beadagolt maltáz %-os gátlását. A %-os gátlást a jug inhibitor + ME++ hányados függvényeként visszük fel, a görbéről leolvassuk az 50%-os gátlás pontját és átszámítjuk MIE/mg inhibitor értékre. A fenti hányadosban + jelentése: szárazanyagra számítva és ++ jelentése: maltáz egység a nem gátolt részben. Minthogy ebben az egyszerű rutinvizsgálatban mesterséges szubsztrátummal és nem a maltáz eredeti szubsztrátumával (maltóz) dolgozunk, a készítményeket maltáz gátló hatás szempontjából pótlólag megvizsgáljuk a Dahlquist által leírt maltáz próba szerint (Enzym, biol. clin. 11, 52/1970). Ennek során a maitáznak a maltózra gyakorolt hatásakor keletkező glükózt enzimatikusan mérjük glükózoxidáz, peroxidáz és dianizidin segítségével kolorimetriás módszerrel. Az összes itt leírt maltáz inhibitor ebben a próbában is gátol. Pozitívnak tekintendők azok a törzsek, amelyeknek esetén a megadott tesztek eredményeként a három hányados egyike [amiláz-inhibitor-egység (AIE), illetve maltáz-inhibitor-egység (MIE), illetve szacharáz-inhibitor-egység (SIE)]: (mg inhibitor), ahol a „mg inhibitor" szárazanyagra és a fent 3
