169136. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dezoxi-amino-glükozidok előállítására amino-glükozidok dehidroxilezésével
11 169136 12 juk. A kapott maradékhoz 200 térfogatrész desztillált vizet adunk, majd a vizes oldatból az oldhatatlan anyagokat kiszűrjük és 100 térfogatrész etil-acetátban feloldjuk. Az etil-acetátos fázist közben 100 térfogatrész vízzel mossuk, majd a vizes fázist elválasztjuk, csökkentett nyomáson betöményítjük és az előbb kapott szűrlettel elegyítjük. Az így kapott elegyet ezután fel visszük egy, 185 térfogatrész kationcserélő gyantával (Amberlite IRC-50 - NH4 + ionokkal töltött állapotban) töltött oszlopra. Az oszlopot 130 térfogatrész vízzel mossuk, majd 1000 térfogatrész 1 n ammónium-hidroxid-oldattal eluáljuk. Az eluátumot csökkentett nyomáson 100 térfogatrészre betöményítjük, majd a koncentrátumot 275 térfogatrész kationcserélő gyantával (Amberlite CG—50 — NH4 + ionokkal töltött állapotban) töltött oszlopra felvisszük. Az oszlopot vízzel mossuk, majd frakcionáljuk lineáris gradiens eluálással 1000 térfogatrész vízzel és 1000 térfogatrész 0,3 n vizes ammónium-hidroxid-oldattal eluálva. A 3'-klór-3'-dezoxi-xilosztazint tartalmazó frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson szárazra pároljuk és liofilizáljuk, amikor is 0,505 súlyrész 3'-klór-3'-dezoxi-xilosztazin-dihidrátot kapunk. Elemzési eredmények a Ci 7H33N4O8CI • 2H2 0 képletre: számított: C =40,12%, H =7,33%, N =11,01%, Cl = 6,97%, talált: C =40,08%, H = 7,29%, N = 10,73%, Cl = 6,55%. Optikai forgatóképessége: [ajn* =+29,7° (koncentráció: 0,6% oldószer víz). A termék Rf értéke 0,41 vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatban szilikagél-üveglapot (a Merck Amerikai Egyesült Államok-beli cég „Art. 5721" márkanéven forgalomba hozott terméke) használva olyan oldószereleggyel, amely kloroform: metanol : vizes ammónium-hidroxid-oldat, víz (4:3:2:1) elegy felső fázisának 5 térfogatrészéből és 3 térfogatrész metanolból áll. A kontrollanyagként alkalmazott szabad xilosztazin Rf értéke ugyanilyen mérési körülmények között 0,23. A kiindulási anyagként használt xilosztazin-3'-foszfátot Escherichia coli No. RÍ 1 (FERM-P No. 2123, ATCC-21990) mikroorganizmus enzimjének felhasználásával végzett foszforilezés útján állítjuk elő. 0,5% élesztőkivonatot, 0,5% polipeptont és 0,3% húskivonatot tartalmazó, 200 térfogatrész vizes törzstáptalajt (pH-értéke 7,2) beoltunk Escherichia coli Rll mikroorganizmussal, majd rázatás közben 37 C°-on 16 órán át tenyésztünk. A törzstenyészettel ezután beoltjuk a fentiekkel azonos összetételű, 1800 térfogatrész mennyiségű „fő" táptalajt (pH értéke 7,2), majd rázatás közben 37 C°-on 4 órán át tenyésztünk. A fermentlét ezután centrifugáljuk, és így 4,4 súlyrész mennyiségben nedves sejteket különítünk el. A sejteket ezután szuszpendáljuk 17,6 térfogatrész 0,05 mólos foszfátpufferrel (pH értéke 7,0). A szuszpenziót ezután ultrahangos oszcillátorral (gyártó cége Kaijo Denki Co., Ltd. japán cég, 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 típusa T-A-4201, 4280, 2A) kezeljük a sejtek elroncsolására, majd az oldhatatlan anyagot centrifugálás útján elkülönítjük, amikor is 17 térfogatrész nyers enzim-oldatot kapunk. A 17 térfogatrésznyi nyers enzim-oldathoz 5 súlyrész xilosztazint, 50 térfogatrész 0,5 mólos foszfátpuffert (pH értéke 7,0), 100 térfogatrész 1 mólos adenozin-trifoszfát-oldatot, 50 térfogatrész 0,1 mólos magnézium-acetát-oldatot és 50 térfogatrész 0,1 mólos 2-merkapto-etanol-oldatot adunk, majd a keveréket desztillált vízzel 500 térfogatrészre feltöltjük. A keveréket ezután az enzimreakciónak kedvező körülmények biztosítására 37 C°-ön tartjuk 20 órán át. A reakció megszakítására ezután a reakcióelegyet 5 percen át 80 C°-on tartjuk, majd centrifugáljuk. A felülúszó fázist ezután 900 térfogatrész kationcserélőgyantával (Amberlite IRC—50 — NH4 + ionokkal töltött állapotban) töltött oszlopra visszük fel. Az oszlopot vízzel mossuk és 1 n vizes ammónium-hidroxid-oldattal eluáljuk, amikor is xilosztazin-3 '-foszfátot tartalmazó frakciókat kapunk. Ezeket a frakciókat összegyűjtjük és 150 térfogatrész kationcserélő gyantával (Amberlite CG-50 - NH4 + ionokkal töltött állapotban) töltött oszlopra visszük fel. Az oszlopot vízzel mossuk és frakcionáljuk lineáris gradiens-eluálással, 1200 térfogatrész desztillált vízzel és 1200 térfogatrész 0,2 n vizes ammónium-hidroxid-oldattal eluálva. A xilosztazin-3'-foszfátot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, csökkentett nyomáson betöményítjük és liofilizáljuk, amikor is fehér por alakjában 4,4 súlyrész xilosztazin-3'-foszfát-monohidrátot kapunk. Elemzési eredmények: a C1 7H 3 sN 4 0 1 3P • H 2 0 képletre: számított: C =36,96%, H = 6,75%, N = 10,14%, P =5,61%, talált: C = 37,52%, H = 6,73%, N = 9,78%, P =5,41%. Optikai forgatóképesség [a]o4 = +40,0° (koncentráció: 0,60%, oldószer víz). A termék Rf értéke 0,55 vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatban szilikagél-üveglapot (Merck -Art. 5721) használva olyan oldószereleggyel, amely kloroform : metanol : 28%-os ammónium-hidroxid-oldat : víz (4:3:2:1) elegy felső fázisának 5 térfogatrészéből és 3 térfogatrész metanolból áll. A kontrollanyagként alkalmazott szabad xilosztazin Rf értéke ugyanilyen mérési körülmények között 0,23. A fenti termék további pontos elemzési adatainak mérése céljából a xilosztazin-3'-foszfát-monohidrátot acetilezzük, amikor is tetra-N-acetil-xilosztazin-3'-foszfát-dihidrátot kapunk, amelynek elemzése az alábbi: Elemzési eredmények a 025^30! 7 P • 2 H 2 0 képletre: számított: C =36,96%, H = 6,75%, N = 10,14%, P =5,61%, talált: C =37,52%, H = 6,73%, N = 9,78%, P =5,41%.
