169119. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nem-patogén bovin rhinotracheitis vírustörzs és élő legyengített bovin rhinotracheitis virus-vakcina előállítására
3 169119 4 szített oldatát használjuk. Ez az oldat salétromossavra nézve 1 normál, míg acetát-ionra nézve 0,25 normál koncentrációjú lehet. A vírust 1—15 percig kezeljük a pufferolt salétromossav-oldaítal, például úgy járunk el, hogy a kezelést szobahőmérsékleten, 4,6 ±0,1 pH-értéken 10 ± 1 percig végezzük. Az így kialakított, hőmérsékletre érzékeny mutáns törzset ezután a fertőző rhinotracheitis vírus növekedésének elősegítésére alkalmas bármilyen ismert sejttenyészetben végzett sorozattenyésztés útján különítjük el. Teljes mértékű elkülönítést érhetünk el például primer embrionális marhavese-sejttenyészet (PFBK tenyészet) alkalmazásával, ha a sorozattenyésztést 30 ± 1 C°-on 10-20 napig, előnyösen 14 ± 1 napig végezzük. Az elkülönített törzset ezután heterológ sejttenyészetekben a teljes mértékű legyengítés eléréséig — azaz a patogenicitás megszűnéséig — további sorozattenyésztésnek vetjük alá. így például primer nyúl-vese (PRK) sejttenyészeten 30-37 ± 1 C° hőmérsékleten 5—15 sorozattenyésztési lépést végzünk, mielőtt a vírust vakcinaként vagy vakcinakészítéshez felhasználnánk. A vírust előnyösen 37 + 1 C°-on, 10 lépésben tenyésztjük a fenti szubsztrátumon. A találmány szerinti eljárással előállított, genetikailag stabil, nem patogén fertőző bovin rhinotracheitis-vírustörzset saját törzsgyűjteményünkben IBR RLB 106 számon helyeztük letétbe. E gyűjteményből írásbeli kérelemre törzsmintákaí adunk ki. A vírustörzset az „United States Department of Agriculture" (Peoria, Illinois, Amerikai Egyesült Államok) intézetben NRRL 5671 számon helyeztük letétbe. A heterológ sejttenyészeten végzett sorozattenyésztés egyes lépéseinek időtartama nem döntő jelentőségű, a találmány szempontjából csak az a lényeges, hogy a vírus összegyűjtése és a következő tenyésztési lépés közegébe való átoltása előtt vírus-növekedés lépjen fel. A sorozattenyésztési lépések időtartamát természetesen nem célszerű túlzott mértékben elnyújtani. Az egyes tenyésztési lépéseket célszerűen maximálisan 1 hétig végezzük. Az így kapott új mutáns törzs lényegében megtartja a kiindulási patogén IBR vírustörzs immunogenicitását, lényeges eltérés azonban a kiindulási törzstől az, hogy az új mutáns törzs hőmérsékletre érzékeny, azaz növekedése a letörési hőmérsékletnél (39 ± 0,5 C°-nál) magasabb hőmérsékleteken igen nagy mértékben visszaszorul, és az új mutáns törzs nem patogén. Ennek megfelelően az új mutáns törzs igen előnyösen alkalmazható élő fertőző bovin rhinotracheitis vírus-vakcinák előállítására. A vakcinákat bármilyen ismert vakcinakészítési és stabilizálási eljárással előállíthatjuk. A találmány szerint tehát fertőző bovin rhinotracheitis vírus hőmérsékletre érzékeny mutánsának képzésével, e mutáns elkülönítésével, majd a patogenicitás megszűnéséig heterológ sejttenyészeten végzett sorozattenyésztésével előállított legalább egy fertőző bovin rhinotracheitis vírustörzset tartalmazó élő fertőző bovin rhinotracheitis vírus-vakcinákat is előállítunk. Ennek megfelelően a találmány tárgya továbbá eljárás élő, nem-patogén fertőző bovin rhinotracheitis vírus-vakcina előállítására, amelynek során a fenti módon előállított hőmérsékletre érzékeny, nem-patogén fertőző bovin rhinotracheitis vírustörzset a fertőző bovin rhinotracheitis vírus növekedésére ákalmas bármilyen ismert sejttenyészeten, 5 például bovin sejtvonal-tenyészeten v?«y primer bovin sejttenyészeten, legcélszerűbben primer embrionális o bovin vese (PBFK) sejttenyészeten, 37 ± 1 C°-ot meg nem haladó hőmérsékleten, előnyösen 30-32 ± 1 C°-on megfelelő vírusnövekedés-10 hez elegendő ideig inkubálunk, és a kapott vírusanyagot összegyűjtjük. Az így kapott élő fertőző bovin rhinotracheitis vírus-vakcinát legalább 104' 2 TCÍD 50 (a sejttenyészetet 50%-ban fertőző dózis), célszerűen 10 s' 2 15 TCIDso dózisegységekben helyileg adagoljuk az orrgaratba. Vakcinás felhasználáshoz a vírust előnyösen fagyasztva szárított formában tároljuk, és a vakcinát közvetlenül a felhasználás előtt állítjuk elő úgy, 20 h °gy a vírusanyaghoz vizet vagy bármilyen egyéb, az orr kezelésére szánt készítmények (például cseppek vagy permetek) előállítására alkalmas gyógyszerészeti hígítószert vagy kompozíciót adunk. 25 A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. A példákban a „megengedett hőmérséklet" megjelölésen azt a hőmérséklet-intervallumot értjük, 30 amelyen mind az alaptörzs, mind pedig a hőmérsékletre érzékeny mutáns törzs szaporodásra képes. A „meg nem engedett hőmérséklet" olyan hőmérsékleti értékeket jelöl, amelyeken a hőmérsékletre érzékeny mutáns törzs szaporodása igen nagy mér-35 tékben gátolt, az alaptörzs szaporodóképessége azonban változatlan. 1. példa 40 IBR 3760 patogén, fertőző bovin rhinotracheitis vírustörzset (tipikus klinikai esetből elkülönített IBR vírustörzs primer bovin vese-sejttenyészeten 121épéses sorozattenyésztésével kapott mikroor-45 ganizmus) primer embrionális bovin vese-sejttenyészeten 43 lépésben sorozattenyésztésnek vetünk alá, és az utolsó lépésben kapott tenyészet felső folyadékfázisát elkülönítjük. így 106' 5 TCID S0 /ml koncentrációjú vírus-szuszpenziót kapunk. 50 1 ml így kapott vírus-szuszpenzióhoz 0,5 ml 4 mólos vizes nátriumnitrát-oldat 0,5 ml 1 mólos ecetsav-nátriumacetát pufferoldattal készített oldatát adjuk. Az elegy végső pfl-értéke 4,6. (A pufferoldat előállítása során 1 térfogatrész desztillált víz-55 zel készített, 30 percig 121 C°-on sterilizált jégecet-oldatot (6g jégecet desztillált vízzel 100 ml-re hígítva) 3 térfogatrész, 13,6 g nátriumacetát 100 ml desztillált vízzel készített, 30 percig 121 C°-on sterilizált oldatával keverünk össze.) 60 Az elegyet 10 percig szobahőmérsékleten tartjuk, majd az elegybe keverés közben, pH = 7,5 ± 0,5 érték eléréséig 1 n nátriumhidroxid-oldatot csepegtetünk, és így a reakciót leállítjuk. A pH-változást fenolvörös indikátorral mutatjuk ki, amelyet a ví-65 rus-szuszpenzióhoz adunk. 2
