169119. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nem-patogén bovin rhinotracheitis vírustörzs és élő legyengített bovin rhinotracheitis virus-vakcina előállítására
5 169119 6 A kapott elegyet azonnal dialízisnek vetjük alá, és 5 órán át +4 ± 1 C°-on foszfátpuffer-sóoldat (összetétel: 8g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na2HP0 4 , 0,2 g KH2 P0 4 , desztillált víz ad 800 ml) és 100 ml desztillált vízzel készített MgCl2 • 6H 2 0 oldat ele- 5 gyével szemben dializáljuk. Ezután a dialízist 0,1 g kalciumklorid 100 ml desztillált vízzel készített oldatával szemben folytatjuk. A végső oldatot (amelynek pH-ja 7,2 és 7,4 közötti érték) szűréssel sterilizáljuk. Ezt a műveletet a nitrit-anion elíávo- 10 lítása érdekében többször megismételjük. A kapott oldat mintáját titráljuk, majd a vírus-forrást —70 C°-on tároljuk. A tiírálást kémcső-kísérlettel, végpont-hígításos módszerrel végezzük primer embrionális bovin vese szövettenyészeten, meg nem 15 engedett hőmérsékleten (39 ± 1 C°-on). Hígításonként 2 kémcsövet használunk fel. 2 hetes inkubálási idő elteltével a faktort feljegyezzük, és a - -70 C°-on tárolt mintát 1 TCIDso /0,2ml koncentrációra hígítjuk. Ezzel a 20 hígított mintával 28 db, primer embrionális bovin vese szövettenyészetteí töltött kémcsövet oltunk be, l-l kémcsőhöz 0,1 ml oltóanyagot használunk fel. A kémcsöveket a megengedett hőmérsékleten (30±lC°-on) inkubáljuk. Váltakozó, 7-17 nap 25 közötti inkubációs idő után 10 beoltott kémcső tartalma tipikus ÍBR-citopatogén hatást mutat. [Amer. J. Vet. Res. 29, 1355 (1968)]. Ezeket a kémcsöveket 1-től 10-ig terjedő számokkal jelöljük, és -70 C°-on tároljuk. E tíz pozitív mintát a 30 megengedett hőmérsékleten (30 C°-on) és a meg nem engedett hőmérsékleten (39 C°-on) párhuzamosan titráljuk. Azokat a mintákat, amelyeknek a megengedett, illetve a meg nem engedett hőmérsékleten mért faktora lényegesen eltér egymástól, 35 határhígítási sorozatban tovább tenyésztjük. Ezzel a módszerrel, a 6. számú minta 10~s hígítású tenyésztésében kapott pozitív minták egyesítésével, az RLB 105 jelű törzs szuszpenzióját kapjuk. 40 Az így kapott RLB 105 törzset érzékeny borjakon vizsgálva megállapítottuk, hogy a törzs még mutat némi maradék patogenicitást (intranazáíis beadás után enyhe orrváladék-ürülést észleltünk). Ezután az RLB 105 törzset primer nyúl vese 45 sejttenyészeten tíz lépésben sorozattenyésztésnek vetjük alá. A sorozattenyészíést a következőképpen végezzük: Vese-donorként specifikus patogénmentes te- 50 nyészetből származó, 3—6 hetes nyulakat használunk. A nyulak veséit aszeptikus körülmények között eltávolítjuk. Az aprított veseszövetet foszfátpuffer-sóoldat (összetétel: 8g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na2HP0 4 , 0,2 g KH 2 P0 4 , desztillált víz ad 55 800 ml) és 100 ml desztillált vízzel készített MgCl2 • 6H 2 0-oldat keverékével, majd 0,1 g CaCl 2 100 ml desztillált vízzel készített oldatával mossuk, a végső oldatot, amelynek pH-ja 7,2 és 7,4 közötti érték, szűréssel sterilizáljuk, majd 2,5 g/liter kon- 60 centrációjú pufferolt nátriumkloridos tripszin-oldattal tripszinezzük, és az elegyet 10 percig 37C°-on folyamatosan keverjük. Ezután a folyadékot elöntjük, és azonos térfogatú friss tripszin-oldattal helyettesítjük. A tripszinezést keverés közben a szö- 65 vet kimerüléséig folytatjuk, miközben a folyadékban szuszpendált sejteket időről időre eltávolítjuk. Végül az elegyet 1000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk, és a sejt-üledéket a növesztő táptalajjal (10%-os vírusmentes borjúszérummal és milliliterenként 100 egység penicillin G-nátriumsóval és 100 meg sztreptomicin-szulfáttal kiegészített Eagle-féle alap-táptalaj) elegyítjük. így körülbelül 200 000 sejt/ml koncentrációjú szuszpenziót kapunk. A kapott sejtszuszpenzió 1—1 ml-es mintáit steril kémcsövekben 4-5 napon át 37 C°-on inkubáljuk. E kezdeti inkubációs idő elteltével a növesztő táptalajt eltávolítjuk, és minden egyes kémcsőbe 1,5 ml Eagle-féle alap-táptalajt töltünk, amelyhez adalékként csak 2%-os gamma-vírusmentes borjúszérumot (steril borjúszérum, a Hyland Travenol, Los Angeles cég terméke) adtunk. Tíz kémcsövet 0,2 ml, a fentiekben kapott RLB 105 vírus-szuszpenzióval oltunk be, és 3-5 napig 37 C°-on inkubáljuk. A vírus-növekedést a citopatogén hatással mutatjuk ki. A vírus következő sorozattenyésztési lépését friss primer nyúl vese szövettenyészeten akkor végezzük, amikor már a sejtek körülbelül 50%-a citopatogén hatást mutat. Ekkor a felső folyadékfázist elkülönítjük, és a sorozaítenyésztés következő lépésében 0,2 ml így kapott folyadékot használunk fel oltóanyagként. A sorozattenyésztés utolsó lépésében kapott felső folyadékfázisokat elkülönítjük, egyesítjük, stabilizáló oldattal („FG-oldat", összetétele: 60 g kaziton (kazein-hidrolizátum), 100 g szacharóz, 75 ml 1/15 mólos dinátrium-hidrogénfoszfát oldat, 25 ml 1/15 mólos kálium-dihidrogénfoszfát oldat, 20 g monokálium-glutamát, desztillált víz ad 4,25 liter) 1 :2 térfogatarányban elegyítjük, és a kapott elegyet fagyasztva szárítjuk. Az IBR RLB 106 vírustörzset kapjuk. Az IBR RLB 106 vírustörzs jellemzői: A vírus különböző hőmérsékleteken észlelhető növekedését titrálással határoztuk meg. Az eredményeket az 1. táblázatban közöljük. A táblázat szerint a íetörési hőmérséklet 39C°±0,5C°. összehasonlításként közöljük az alaptörzs megfelelő hozam-adatait is. Az adatok összehasonlításából kitűnik, hogy az IBR RLB 106 törzs a 39 C°-os határhőmérsékleten már csak igen kismértékű szaporodásra képes, míg az alaptörzs reprodukciós képessége változatlan. 1. táblázat Vírus-hozam log10 /0,l ml Törzs (TCIDjo) egységekben 30 C°-on 39 C°-on IBR RLB 106 5,75 0,75 IBR 3760 5,75 5,75 3
