169116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigén, haptén vagy antitest kimutatására és meghatározására
7 169116 8 Az oldhatatlanná átalakított anti-antitest különböző méretű részecske-alakban alakítható át, pl. szemcséket, pelyheket, rudacskákat vagy más hordozóanyag csíkokat alkalmazhatunk. A találmány szerinti eljárás kivitelezéséhez előnyösen ún. próbacsomagot készítünk. Ez a próbacsomag lényegében a következő komponensekből áll: 1. antigén vagy hapten és egy enzim-konjugátum ismert mennyisége, 2. ismert mennyiségű antitest, 3. oldhatatlan anti-antitest. A próbacsomag az enzim meghatározásához szükséges további reagenseket, ezenkívül a próba elvégzéséhez szükséges segédanyagokat, mint kémcsövet, pipettát és hígított folyadékot tartalmazó palackokat is tartalmazhat. Ilyen próbacsomag alkalmas egy antigén vagy hapten, de egy antitest meghatározására is, ez utóbbi esetben a próbacsomagban levő antitestet természetesen nem szükséges alkalmazni. A találmány szerint előállítható próbacsomag pontos kiviteli alakja felhasználható gonadotrop hormonok, főként a HCG (emberi korion gonadotrop-hormon) meghatározására, így nagyon korai fázisban alkalmas a terhesség kimutatására. Ilyen próbacsomag egy ampullából, kémcsőből, palackból vagy más, a legfontosabb komponenseket magában foglaló tartályból áll és egymástól elkülönített liofilizált rétegek alakjában előre meghatározott mennyiségeket tartalmaz az alábbi komponensekből: a) HCG antigén és egy enzim, pl. peroxidáz konjugátuma, b) anti-HCG, c) oldhatatlan anti-antitest, d) adott esetben más komponensek, pl. egy pufferanyag. Ha az így készített próbacsomaghoz egy feltehetően terhes nő vizeletének meghatározott mennyiségét adjuk és a vizeletet a próbacsomag komponenseivel elkeverve inkubáljuk. így egy oldhatatlan anyagból álló keveréket kapunk, amelynek a felső fázisa az oldható HCG-enzim-konjugátumot tartalmazza. Az utóbbi mennyisége függ a vizsgálandó vizeletben levő HCG-mennyiségétől. A megmaradt HCG-enzim-konjugátum enzimaktivitását meghatározva megállapítható, hogy a vizelet ténylegesen terhes nőtől származik-e. Az enzimaktivitás meghatározásának egyik előnyös foganatosítási módja szerint enzim-reagensekkel impregnált indikátorpapírt (pl. peroxidáz felhasználása esetén egy H2 0 2 -t leadó anyagot, mint karbamid-H2 0 2 -származékot) és egy színezőreagenst, pl. o-kloridint érintkeztetünk. A reagensek mennyiségének pontos beállításával a terhesség igen korai stádiumban kimutatható, rendkívül egyszerű, gyors és megbízható módszerrel, amelyhez még szakképzett személyzet sem szükséges. 1. példa Emberi koriongonadotrop hormon (HCG) meghatározása 5 a) HCG-HRP készítése (antigén-enzim-komplex) 5 mg HCG-t (Organon készítmény, 10 12 000NE/mg) és 20 mg torma (horse radish) -peroxidázt (HRP) (Miles-Seravac készítmény) feloldunk 6,2 pH-értékű 2 ml 0,05 mólos foszfátpufferben. 40mikroliter 25%-os glutáraldehid oldat hozzáadása után a keveréket 2 óra hosszat rázzuk 15 szobahőmérsékleten. 250 g nehézségi erő behatása alatt 5 perces centrifugálás után a kapott folyadékot, Saphadex G-200 oszlopon 6,2 pH-értékű 0,05 mólos foszfátpufferrel frakcionáljuk. 20 A legnagyobb %-os enzimaktivitást mutató frakciókat használjuk fel. b) A HCG-vel szembeni antitest készítmény előállítása (antitest) 25 A HCG-vel szembeni antitestként viselkedő anyag nyúlba beoltva állítható elő Schuurs és munkatársai módszerével [Acta. Endocr. 59. 12 O (1968)]. 30 c) Nyúl-gamma-globulinnal szembeni antitestek előállítása (antitest) Nyúl-gamma-globulint normál nyúlvérszérumból 35 izolálunk 18súly%-os szilárd nátriumszulfáttal való kicsapással. Ezzel szemben antitestként viselkedő anyagot úgy készítünk, hogy birkát az alábbi előírások szerint immunizálunk: 40 Nap Mennyi- Freund-féle Injekciós módszer ség adjuváns 0 0,5 mg + intramuszkuláris 14 0,5 mg + intramuszkuláris 28 1 mg + intramuszkuláris 42 1 mg -intravénás 56 1 mg — intravénás A Freund féle adjuváns DIFCO készítmény (összetételét lásd a Methods of Immunology I. kö-55 tet II. fejezetében, Academic Press, New York, 1967.). A 70. napon a birka vérét lecsapoljuk. d) Az immunoabszorbens-cellulóz 60 (birka-anti-/nyúl-gamma-globulin) előállítása (HCG-anti-antitest) v Az 1 c) módszerrel készített birkaszérum gamma-globulin frakcióját 16 súly%-os nátriumszulfáttal 65 való kicsapással izoláljuk. Mosás után a csapadékot 4
