169116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigén, haptén vagy antitest kimutatására és meghatározására
9 169116 10 felvesszük 8,6 pH-értékű 0,05 mólos borát-pufferben oly módon, hogy a fehérjekoncentráció 10 mg/ml legyen. 350 ml m-amino-benziloxi-metilcellulózt (Whatman-féle cellulózból előállítva) 50 ml desztillált víz- 5 ben szuszpendalunk és a szuszpenziót 10 ml 36%-os sósav és 10 ml 10%-os nátriumnitrit oldat becsepegtetésével diazotáljuk 0 C°-on. A szuszpenziót centrifugáljuk, mossuk, a csapadékot 43 ml 8,6 pH-értékű 0,05 mólos nátriumborátban ismét 10 szuszpen dáljuk, ezután 7 ml előbb elkészített gamma-globulin-oldatot adunk hozzá. A keveréket 26 óra hosszat 4 C°-on keverjük, majd centrifugáljuk és 6,0 pH-értékű 0,02 mólos foszfátpufferrel mossuk. 15 e) A HCG meghatározása A HCG egy sorozathígítási mintáit (32-16-8--4—2—1-0,5-0 nemzetközi egység/ml) készítjük 2 rj el, 6,0 pH-értékű 0,02 mólos foszfátpufferben, amely 2 térfogatszázalék normál birkavérszérumot tartalmaz. 0,5 ml HCG-tartalmú mintát 0,1 ml nyúlszérummal (anti-HCG) és 0,1 ml HCG-HRP konju- 2 5 gátummal inkubálunk, 1/2 óra hosszat szobahőmérsékleten, (a hígításnál azt tartjuk szem előtt, hogy a HCG-HRP komplexet tartalmazó oldat extinkciója 0,4 egység legyen 1 cm-es rétegvastagságban. Az anti HCG mennyiségének megválasztásánál arra 30 törekszünk, hogy az a HCG-HRP komplex mennyiségének 80%-át megkösse), azután 0,3 ml d) példa szerinti módon készített immunoabszorbenst (10 mg/ml) adunk hozzá és a képződött keveréket szobahőmérsékleten 1 óra hosszat kever- 35 jük. Centrifugálás után a felső fázisban levő enzimaktivitást úgy mérjük, hogy 0,5 ml fenti folyadékot 1,5 ml szubsztrátummal (10 mikroliter 30%-os H2 0 2 és 20 mg 5-aminoszalicilsav 150 ml 6,0 pH-értékű 0,02 mólos foszfátpufferben) elkeverjük 40 és 30 perc állás után 25 C°-on az extinkciót mérjük 460 nm hullámhosszon. Ezzel a módszerrel lehetővé válik a HCG-koncentráció kimutatása 0,5 liter nemzetközi egység/ml mintaméretben. Ezzel a módszerrel vizeletminták is 45 megvizsgálhatók, ezért a fenti módszer alkalmas terhesség kimutatására. A jelenlegi hemagllutináció-inhibitáló próba és a találmány szerinti próba közötti megegyezés jónak mondható. A kísérleti rendszer érzékenységét növelhetjük oly módon, 50 hogy a mintát először az antitesttel inkubáljuk, majd ehhez adjuk hozzá a HCG-HRP-konjugátumot. 2. példa Inzulin és antiinzilin meghatározása a) Inzulin(glukóz-oxidáz) készítése 60 (antigén-enzim komplex) 5 mg sertés inzulint (Organon készítmény) és 25 mg glukóz-oxidázt (Boehringer-készítmény) 2 ml 6,5 pH-értékű 0,05 mólos foszfátpufferben felöl- 65 dunk. Ehhez az oldathoz 5 mikroliter 25%-os glutáraldehid-oldatot adunk, ezt követően a keveréket 90 percig szobahőmérsékleten rázogatjuk. A keveréket ezután Sephadex G—200 oszlopon frakcionáljuk 6,5 pH-értékű 0,05 mólos foszfátpufferrel. A legnagyobb enzimaktivitást mutató frakciókat köthetjük az inzulinnal szemben antitestként viselkedő anyagokkal, amelyeket a jelenlegi kísérleti rendszerben használunk. b) Az inzulinnal szembeni antitest előállítása (antitest) 10 db tengerimalacnak hetenként intramuszkuláris injekció alakjában 1 mg sertésinzulint tartalmazó teljes Freund-féle adjuvánst adunk, 4—8 hétig. Két hetes állás után az állatoknak adjuváns nélkül intravénás injekcióval további 1 mg inzulint adunk. Két héttel később az állatok vérét lecsapoljuk. Az időközben fellépő hipoglikaémiát intraperitoneálisan adott glukózzal ellensúlyozzuk. c) Tengeri malac-gamma-globulinnal szembeni antitestek készítése (antigén-antitest) Tengeri malac-gamma-globulint készítünk oly módon, hogy 1 térfogatrész telített ammóniumszulfát oldatot 2 térfogatrész tengerimalac vérszérumhoz adunk. A kapott csapadékot 33%-os telített ammóniumszulfát oldattal kétszer mossuk, majd fiziológiás konyhasó-oldatban felvesszük. Birkát növekvő dózisban beadott 0,5, 1 és 2 mg elkészített gamma-globulinnal immunizálunk. Az injekciókat 2 hetenként adjuk és az immunogén anyagot elkeverjük teljes Freund-adjuvánssal. Az utolsó injekció beadását követő 2 hét eltelte után egy további 2 mg-os gamma-globulint adunk fiziológiás konyhasó-oldatban, majd 1 héttel később az állatok vérét lecsapoljuk. d) Tengeri malac-gamma-globulin ellen felhasználható oldhatatlan antitestek készítése (antigén-anti-antitest) 10 g mikrokristályos cellulózt (Merck készítmény) aktiválunk oly módon, hogy keverés közben 400 ml 2,5 súly%-os ciánbromid oldatot adunk hozzá, majd a pH-értéket 1 n nátriumhidroxid-oldattal 10,5-re állítjuk be és 2 percig ezen az értéken tartjuk. Ezután a cellulózt jegesvízzel és 0,1 mólos nátriumhidrogénkarbonáttal mossuk. 10 ml birka-anti(tengerimalac-gamma-globulin) szérumhoz 1,6 g nátriumszulfátot adunk. 1 órás keverés után szobahőmérsékleten a kapott csapadékot centrifugáljuk, 20 ml 16súly%-os nátriumszulfát-oldattal kétszer mossuk, majd 10 ml 0,1 mólos nátriumkarbonát-oldatban felvesszük. Az aktivált cellulózt 40 ml 0,1 mólos nátriumhidrogénkarbonát-oldattal elkeverjük, majd 10 ml gamma-globulin-oldatot adunk hozzá. A szuszpenziót 40 óra hosszat 4 C°-on forgógépben rázogatjuk, majd kétszer 500—500 ml 0,5 mólos nátriumhidrogénkarbonáttal, 500-500 ml 0,05 mólos 1,1 pH-értékű citráttal, majd kétszer 500-500 ml 6,2 pH-értékű 0,05 mólos foszfáttal mossuk. 5
