169116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigén, haptén vagy antitest kimutatására és meghatározására

169116 sokhoz képest. Ennek megfelelően a találmány szerinti módszer kivitelezése, az anti-antitest adagolása, az inkubálás, a centrifugálás és szűrés igen egyszerűen kivitelezhető. Az adagolás gyakran még könnyebb, mint a szilárdfázisú módszereknél, mivel elegendő az oldhatatlan anyagot feleslegben adagolni, míg az ismert szilárdfázisú módszereknél pontosan kimért mennyiségeket kell alkalmazni. Ezenkívül a kötőfehérje érzékenysége a köthető anyag szempontjából nem függ a hordozóanyaghoz való kapcsolódás mértékétől, ami önmagában fontos szempont az ún. szilárdfázisú módszereknél. További előnyt jelent a szilárdfázisú módszerekhez képest az antitest és a köthető anyag közötti reakció gyors egyensúly-beállása, ha mindkét komponens oldatban van. A kettős antitest módszer ezenkívül szükségessé teszi „hordozóanyagként" gamma-globulin adagolását és ennek megfelelően számos másodlagos antitest alkalmazását, az immuncsapadék előállítása céljából. A találmány szerinti DASP módszer egyszerűségén kívül „hordozóanyagként" gamma-globulin felhasználását sem igényli, így anyagigénye szempontjából is gazdaságos. Ehhez hozzájárul az, hogy a transzport vagy receptor fehérjéknél használt kettős antitest-szerű elválasztás nem kivitelezhető az erre a célra megfelelő „hordozó" fehérje hiányában. Ilyen tekintetben tehát a találmány szerinti eljárás egyedüli lehetőséget biztosít a fehérjék meghatározására. c) a találmány szerinti .eljárás előnyeihez tartozik végül az, hogy könnyen automatizálható. Elvileg lehetséges a reakció-komponenseket egyszerre összehozni, vagy tetszés szerinti sorrendben ada' golni. Azt találtuk azonban, hogy a meghatározás nagyobb érzékenységgel lefolytatható, ha az oldhatatlan anti-antitestet a többi komponens inkubálása után adagoljuk. d) a találmány előnye az eljárás kedvező érzékenysége. A fentiekben ismertetett, a Nature 219. kötetében a 186-189. oldalakon (1968) leírt eljárás érzékenysége 1000, azaz a meghatározandó komponens csak 1000 egység/térfogategység esetében mutatható ki, ezzel szemben a találmány szerinti eljárás érzékenysége 50, vagy ennél kisebb. Tehát ez az eljárás legalább hússzor érzékenyebb az eddig ismert eljárásoknál. A találmány szerinti eljárásnál használt reagens, a hapten vagy antigén enzimmel képzett komplexe ismert módon állítható elő. A komplex-képzés abban az esetben megy végbe, ha legalább az egyik anyag egy vagy több amino-, a másik. pedig egy vagy több karboxil-csoportot tartalmaz. Ha ezek a funkciós csoportok nincsenek jelen, akkor a kívánt csoportokat a kapcsolandó molekulába ismert szerves kémiai módszerekkel kell bevinni. Több módszer ismert arra is, hogy az amino- vagy karboxil-csoportokat egymáshoz kapcsoljuk, éspedig hídkötés vagy másfajta módszer segítségével. Kapcsolásra alkalmas vegyületként felhasználhatók a következők: glutáraldehid, difluor-dinitro-difenilszulfon és di- és tri-klór-s-triazin. Szükségessé válhat az előállított enzim-konjugátumok elválasztása az át nem alakított anyagoktól vagy egy olyan anyagtól, amely inaktívvá vált. Erre a célra valamely ismert biokémiai módszert alkalmazunk, mint a szerves oldószerekkel történő kicsapást, gélszűrést, vagy egy meghatározott fajsúlygrádiens alapján végzett 5 centrifugálást. A kapcsolásra alkalmas enzimet az enzim különböző tulajdonságai alapján választjuk ki. Természetesen döntő jelentőségű az, hogy az enzim ne kapcsolódjék másik molekulához. Döntő jelentőig ségű továbbá az enzim specifikus aktivitása is. Célszerűen azokat az; enzimeket alkalmazzuk, amelyeknél az enzimaktivitás meghatározása egyszerű. Ezek közé tartoznak a kolorimetriás, spektrofotométeres vagy röntgensugárzáson alapuló vizsgálati 15 módszerek. Ezek a meghatározások ugyanis automatizálásra alkalmasak, ami további előnyt jelent. Kolorimetriásan azok az enzimek határozhatók meg, amelyek olyan reakciót katalizálnak, ahol egy 20 színes anyag jelenik meg vagy tűnik el a reakció során. Célszerűen az alábbi enzimeket alkalmazzuk: kataláz, peroxidáz, j3-glukuronidáz, (3-D-glukozidáz, j3-D-galaktozidáz, ureáz, glukózoxidáz, galaktóz-25 -oxidáz és lúgos foszfatáz. A találmány szerint a reakció végén a reakciókeverék enzimaktivitását a folyékony vagy szilárd fázisban vagy mindkét fázisban meghatározzuk. Az enzimaktivitás meghatározása folyadékfázisban egy-30 szerűbb. A példákban alkalmazott glukózoxidáz, galaktóz-oxidáz és HPR enzim meghatározásokat ismert módszerek segítségével végeztük el. [Erre vonatkozóan lásd a Merck-féle „Biochemia" című, enzi-35 mekre vonatkozó kézikönyvet, továbbá a HRP aktivitás meghatározására vonatkozólag az FBS Letters 15 132 oldal (1971) leírását]. Az antitestek előállítását ismert módon végezzük. Az anti-antitestek elkészítésénél tisztított anti-40 testet alkalmazunk, és ezt ismert módon az antitest előállításánál nem alkalmazott állatfajtába injekció útján bevisszük. A kezelt állat vérszérumát vagy annak gamma-globulin-frakcióját oldhatatlanná alakítjhatjuk át, ha azt glutáraldehiddel vagy klór-45 hangyasav-etilészterrel térhálósítjuk vagy szilárd hordozóanyagrészecskékhez kötjük adszorpció útján vagy kémiai módszerrel kovalens kötést képzünk. Szilárd hordozóanyagként használhatók a következők:* cellulóz (módosított vagy nem módosított 50 formában) agaróz, térhálósított dextrán, polisztirol és hasonló anyagok. Ezekhez a hordozóanyagokhoz az antitesteket kovales kötéssel kapcsolhatjuk olyan anyagok, mint a karbodiimidek, di- és tri-klór-s-triazinek, glutáraldehid, ciánbromid segítségével vagy 55 pl. diazotálás útján. A találmány szerinti meghatározási módszer előnyei akkor érvényesülnek, ha az oldhatatlan antitestet feleslegben használjuk, így a meghatározandó antitest teljesen szilárd fázisba megy át. 60 A reagensek alkalmazási formája többfajta lehet. A reakció-rendszer enzim-konjugátum-komponense fagyasztással szárítható vagy egy pufferanyagban feloldható. Felhasználható egy szilárd hordozóanyag is, pl. a konjugátummal impregnált papírcsík. 65 Hasonlóképpen alkalmazhatjuk az antitestet is. 3