169116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigén, haptén vagy antitest kimutatására és meghatározására
169116 3 4 Az ismertetett meghatározási módszerek legfontosabb mozzanata a jelzővegyületek alkalmazása és a jelzővegyület elkülönítése két olyan frakció alakjában, amelynek egyikében a megfelelő komponens kötött vagy nem kötött állapotban van jelen. Az eddigiekben gyakorlati felhasználásra került módszerekben jelzővegyületként kizárólag radioaktív atomokat, mint J131 , Ji2 5> C14 ,H 3 vagy Co57 izotópot alkalmaztak. Ez a módszer kitűnik rendkívül érzékenységével. E módszer alkalmazása azonban olyan intézetekre korlátozódik, amelyek a módszer kivitelezéséhez szükséges speciális berendezésekkel rendelkeznek. Az elválasztási módszereket a következő csoportokba oszthatjuk (lásd fent megadott irodalmi hivatkozást): a) a nem kötött, jelzett komponens és ennek a kötőparínerrel képzett komplexe fizikai tulajdonságainak különbségén alapuló módszerek. Ezek közé sorolható a gélszűrés, elektroforézis, sóval való kicsapás és a dextránnal bevont aktívszén felületén történő adszorpció. b) az ún. szilárd fázisú módszerek, amelyben az egyik komponenst előzetesen térhálósítással vagy kovalens-kötéssel vagy fizikai adszorpcióval egy szilárd hordozóanyagon rögzítve oldhatatlanná teszik és így használják fel. c) Az ún. kettős antitest módszerek, amelyekben az antigén (vagy haptén)-antitest-komplexet olyan antitesttel csapják ki, amely a komplexben levő antitesttel szemben antitest tulajdonságokat mutat, ez utóbbi módszer azonban csak antitestek felhasználásán alapuló eljárásokban alkalmazható. Míg az a) és c) módszerek viszonylag bonyolultan kivitelezhetők, a b) módszernek az a hátránya, hogy mivel a reakciókomponenst oldhatatlan formába kell átalakítani, a reakciópartnerrel szembeni érzékenység csökken. A nagymértékű affinitás azonban rendkívül lényeges a próba érzékenysége szempontjából. A 3 309 275 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás eljárása szerint a vizeletben jelenlevő HCG meghatározása szintetikus gyantarészecskék felületén adszorbeált és proteolitikus enzimmel és/vagy hővel feltárt HCG (HCG-reagens), valamint anti-HCG alkalmazásával történik. A vizsgálandó mintát anti-HCG-vel, majd pedig HCG-reagenssel elegyítik. HCG jelenlétében nem lép fel a HCG-reagens agglutinációja. Ez az ismert eljárás csak a HCG kimutatására alkalmas, más antigén és antitest meghatározására nem, s igen kevéssé érzékeny: alkalmazásával 1700 nemzetközi egység körüli mennyiségű HCG-nél kevesebb nem mutatható ki. Valamely antigén vagy hapten meghatározását a találmány szerint úgy végezzük, hogy a meghatározandó antigénhez (vagy hapténhez) felesleges mennyiségű antitestet adunk. Az antitest reagál a jelenlevő antigénnel. Az eljárás során tulajdonképpen az el nem reagált antitest meghatározását végezzük el. Az összes felhasznált antitest mennyiségből kivonva a reagálatlan antitest mennyiségét megkapjuk az antigénnel reagált antitest mennyiségét. Az oldatban levő reagálatlan antitest meghatározását úgy végezzük hogy az oldathoz a reakcióban résztvevő antigénnek (vagy hapténnek) egy enzimmel készített konjugátumát adjuk. Az oldat-5 ban levő antitest ezzel a konjugátummal reagál. Az oldatban levő felesleges mennyiségű antigén-enzim konjugátumról az antitest-antigén-enzim hármas rendszert úgy különítjük el, hogy az oldathoz szilárd, oldhatatlan anti-antitestet adunk, amely a 10 hármas rendszerrel, az antitest-antigén-enzim konjugátummal reagál. A reakcióba lépő antitest-antigén-enzim megkötődik a szilárd anti-antitest fázison. Az enzim mennyiségének meghatározását elvé-15 gezhetjük az oldatban vagy a szilárd fázisban. A szilárd fázisban levő enzim mennyisége arányos az eljárás első lépésében el nem reagált antitest mennyiségével. Ezt az értéket az összes felhasznált antitest mennyiségéből kivonva megkapjuk az elrea-20 gált antitest, illetőleg az ezzel arányos antigén mennyiségét. Az antitest oly módon határozható meg, hogy a mintát, vagy annak egy sorozathígítását ismert mennyiségű enzimkomplexszel és egy meghatáro-25 zott mennyiségű, az antitesttel szemben oldhatatlanná átalakított antitesttel együtt inkubáljuk. Az enzim csak akkor mehet át oldhatatlan fázisba, ha a konjugátum az antitesttel reakcióba lépett. Minél több kötőfehérje van a szilárd fázisban, annál 30 kevesebb kötött enzim-konjugátum marad a folyadékfázisban. A kísérleti rendszer érzékenysége a reagensek mennyiségi arányának változtatásával szabályozható (éspedig attól függően, hogy azonos vagy ettől 35 eltérő arányokat alkalmazunk). Ennek ellenére az enzim-konjugátum mennyiségének alsó határát az a követelmény határozza meg, hogy enzim-aktivitása még meghatározható szinten maradjon, így a kísérleti rendszer érzékenységének is van egy alsó ha-40 tára. A legkisebb mérhető enzimaktivitás többek között a kapcsolásnál használt enzim érzékenységétől, a szubsztrátum természetétől és az enzimreakció inkubációs időtartamától függ. Ezen kívül az antitest aktivitása erősen befolyásolja a megha-45 tarozás érzékenységét. Igen érzékeny kísérleti rendszerben nagyobb affinitású antitestek alkalmazása szükséges. Az egy-egy meghatározáshoz szükséges reagens mennyiségét kísérleti úton határozzuk meg. 50 A találmány szerinti eljárás előnye az ismertetettekhez képest a következőkben foglalható össze: a) A radioaktív izotópokkal való munka helyettesíthető enzimes módszerrel. Ehhez jóval kevesebb 55 laboratóriumi berendezés és felszerelés szükséges, emellett kevésbé kiképzett személyzet is alkalmas. Ezenkívül a radioaktív izotópokkal végzett munkát különböző biztonságtechnikai előírásokkal szabályozzák. A találmány szerinti reagensek előnye 60 hosszú élettartamuk és az, hogy a munka biztonsága fokozható. b) A „kettős antitest" és ,',szilárd fázis" módszerek kombinációjának — amelyet a következőkben az egyszerűség kedvéért DASP módszernek 65 nevezünk — különböző előnye van az ismert eljárá-2 1
