169074. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 15-hidroxi- prosztaglandin-dehidrogenáz tisztítással egybekötött kinyerésére tüdőkivonatokból

3 * 169074 4 Saeed és Roy [Biochem. Biophys. Res, Comm. 47, 96 (1972)] eljárásnál marhatüdőből kiindulva a foszfátpufferrel készített tüdőkivonatot nagysebességű centrirugálás után ammóniumszulfátos kisózással frakcionálják, majd —15 C°-ra lehűtött acetonnal folytatják a fehérjék frakcionálását. Ennek az eSjárásnak hátránya, hogy a hideg acetonos frakcionálásnál a hatóanyag inaktiválódásából eredően a veszteség nagy (45%-os). Hasonló eljárással Matschinsky, Shanahan és Ellerman [Anal. Biochem. 60, 188 (1974)] viszonylag kis tisztaságú termékhez jutottak (1,5 e/mg fehérje). A találmány célja, hogy a fenti hátrányok kiküszöbölésével lehetővé tegye a 15-hidroxi-prosztaglandin-dehidrogenáz kinyerését jó termeléssel nagy aktivitással és tisztaságban, valamint kellő stabilitással, az enzimes analízishez megfelelő minőségben. A találmány alapja az a felismerés, hogy a tüdőből önmagában ismert módon végzett enzimkivonás után a ballasztanyagok jelentős része eltávolítható a hatóanyagot tartalmazó tüdőkivonat rövid idejű savas kezelésével 5,0 és 5,9 pH között, majd az ilyen pH-nál kiváló és ballasztanyagokat tartalmazó csapadék elkülönítése után- az oldatból a hatóanyag szelektív módon kicsapható 6,0 és 6,5 közötti pH-tactományban diamino-akridin-vegyületek segítségével. Ez a felismerés azért meglepő, mert nem volt slőre várható, hogy viszonylag kis pH-tartományon belül változtatva a pH-értéket éppen a ballasztanyagok jslentős része kiváljék 5,0 és 5,9 pH között, valamint, hogy ezt követően kis pH-érték-változtatással olyan körülmények hozhatók létre, amelyek között a tüdőkivonatban a társfehérjékhez képest kismennyiségű 15-hidroxi-prosztaglandin-dehidiogenáz viszonylag szelektív módon kicsapódik diamino-akridin-vegyületek hozzáadására. Ismeretes módon az izoeiektromos pontok különbségén alapuló lépésekkel eddig a különféle szervekből kinyerhető enzimfehérjék csak kis tisztulási fokkal voltak megkaphatok, mert a fehérjék izoeiektromos pontjai igen köze! esnek egymáshoz. Meglepő továbbá az is, hogy a találmány szerinti eljárás során nem következik be az izoeiektromos ponton egyébként szokásos, jelentős mértékű hatóanyag-inaktiválódás, annak ellenére, hogy a találmány szerinti eljárásban beállított pH-értékek éppen a 15-hidroxi-prosztaglandin-dehidrogenáz izoeiektromos pontjához [pH = 6,0, lásd Anggard, Ann. N. Y. Acad. Sei. 180, 203 (1971)] közeliek. Fentiek alapján a találmány tárgya eljárás 15-hidroxi-prosztaglandin-dehidrogenáz tisztítással egybekötött kinyerésére lúgos pH-jú pufferekkel készített sertés- vagy marhatüdő-kivonatokból, frakcionált kicsapással, a hatóanyagot tartalmazó csapadék káliumbromid-tartalmú oldattal végzett kioldása és az elkülönített oldat vizes pufferoldattal szemben végzett dialízise, majd a dializáit oldatból a víz eltávolítása útján. A találmány értelmében a frakcionált kicsapásnál úgy járunk el, hogy a sertés- vagy marhatüdő-kivonatok pH-értékét savval 5,0 és 5,9 közé, célszerűen 5,6 és 5,7 közé állítjuk be, a csapadékot eltávolítjuk, majd a tiszta oldat pH-értékét 6,0 és 6,5 közé, célszerűen 6,3 és 6,4 közé állítjuk be, és a hatóanyagot valamely diamino-akridin-vegyület, célszerűen 2-etoxi-6,9-diamino-akridin-laktát vagy 3,6-diamino-akridin-dihidroklorid hozzáadásával kicsapjuk. 5 Kiindulási anyagként frissen vágott állatokból származó, egészséges, zsíros részektől és nagyobb hörgőktől megtisztított sertés- vagy marhatüdő felel meg. Az 5,0 és 5,9 pH-érték közé való beállítást 10 előnyösen 0 C° és 10 C° között végezzük. Az elkülönítésre szolgáló centrifugálást összesen legfeljebb 30 percig célszerű végezni a fenti hőmérsékleten azért, hogy a hatóanyag ne károsodjék. A hatóanyag szelektív kicsapásához használt 15 diamino-akridin-vegyület végtöménységét 0,10 súly/ /térfogat% és 0,20 súly/térfogat% közötti, előnyösen 0,13 súly/térfogat% értékre célszerű beállítani. A találmány szerinti eljárás legfőbb előnye, hogy az eljárással kapott termék jelentős aktivitású 20 és tisztaságú (legalább 3 egység/mg szárazanyag, 1 egység megfelel 0,12nanomól prosztaglandin E2 átalakításának percenként, definiált körülmények között), továbbá, hogy a hatóanyag a tüdőkivonatban található mennyiségre vonatkoztatva jelen-25 tős termeléssel nyerhető. A termék tisztasága és hozama meghaladja az irodalomban eddig ismert eljárásokban a kromatográfiás lépéseket megelőző lépésekben elérhető tisztaságot és hozamot. A termék -15C°-on tárolva 4—6 hónapig lényeges akti-30 vitásveszteség nélkül eltartható. Jól oldódik desztillált vízben és híg vizes sóoldatokban. Az eljárás további előnye, hogy nem igényel nagysebességű centrifugálást. A hatóanyag tisztaságát, fajlagos aktivitását és 35 stabilitását tovább lehet fokozni igen jó termelés mellett úgy, hogy a szárított terméket feloldva önmagában ismert módon kromatográfiás úton, egy vagy több gélszűréses lépéssel tovább tisztítjuk, s az aktív kromatográfiás frakciókat egyesítve és be-40 sűrítve önmagában ismert módon stabilizálva tároljuk. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat ismertetjük. A 15-hidroxi-prosztaglandin-dehidrogenáz értékmérése Marrazzi 45 és Matschinsky szerint [Prostaglandins 1, 379 (1972)] történt. 1. példa 50 1,2 kg friss sertéstüdőt megtisztítás után felaprítunk, majd homogenizátorban tisztított szerv-kilogrammonként 2 liter, literenként 0,744 g etiléndiamin-tetraecetsav-dinátriumsót és 0,05% (térfo-55 gat/térfogat) merkapto-etanolt tartalmazó 0,01 M töménységű, pH = 7,4 értékű foszfátpuffer-oldattal kivonatoljuk. Az így kapott szuszpenziót kb. 4C°-on 40-45 percig centrifugáljuk 1200 g értéken, a felülúszót gézen átszűrjük. Ezután 2 N sósav 60 hozzáadásával az oldat pH-ját 5,6-5,7 értékre állítjuk be, és a kiváló, ballasztanyagokat tartalmazó csapadékot 4C°-on 25 percig centrifugáljuk 1200 g értéken. Az így nyert felülúszó pH-ját 2 N nátronlúg hozzáadásával 6,3 és 6,4 közötti értékre állít-65 juk be, s felényi térfogatú 0,4%-os (súly/térfogat) 2