169074. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 15-hidroxi- prosztaglandin-dehidrogenáz tisztítással egybekötött kinyerésére tüdőkivonatokból

5 169074 6 vizes 2-etoxi-6,9-diamino-akridin-laktát („Rivanol", Serva Feinbiochemica, Heidelberg, NSzK) oldatot adunk hozzá. A kivált csapadékot lecentrifugáljuk, a csapadékot a kicsapás előtti térfogat 1/4-részének megfelelő mennyiségű desztillált vízzel mossuk, 5 20-25 percig 1200 g értéken centrifugáljuk, majd a fentemlített térfogat 1/8-részének megfelelő mennyiségű, literenként 0,744 g etiléndiamin-tetraecetsav-dinátriumsót és 0,05% (térfogat/térfogat) merkapto-etanolt, valamint 29,8 g kálium-bromidot 10 tartalmazó, 0,01 M töménységű, pH = 7,4 foszfátpuffért adunk hozzá, s 4C°-on 15 percig kevertetve a hatóanyagot a kicsapószer mellől kioldjuk. 4 C°-on végzett 20—25 perces és 4300 g értékű centrifugálás után a felülúszót a szervkivonásra 15 használt pufferoldattal szemben dializáljuk, majd szükség esetén centrifugálással elválasztva a kivált csapadéktól liofilizáljuk. A kapott sárgás színű 15-hidroxi-prosztaglandin-dehidrogenáz termék súlya 3,5 g, fajlagos aktivitása 3,5 E/mg. Összes termelés: 20 12 250 E. 2. példa 25 1 kg marhatüdőt tisztítása és felaprítása után 2 liter, literenként 0,372 g etiléndiamin-tetraecetsav-dinátriumsót, 0,02% (térfogat/térfogat) merkapto-etanolt és 10 mg nikotinsavamid-adenin-dinukleotidot tartalmazó, 0,05 M töménységű, pH = 7,4 30 értékű foszfátpufferrel kivonatolunk, 45 percig 4C°-on 3500 g értéken centrifugáljuk, majd a felülúszót gézen átszűrjük. Ezután tömény hangyasav hozzáadásával az oldat pH-ját 5,6 és 5,7 közötti értékre állítjuk be, és a kiváló, ballasztanyagokat 35 tartalmazó csapadékot 3500 g értékű, 20 percig tartó centrifugálással elkülönítjük. A felülúszó pH-értékét 2 N nátronlúg hozzáadásával 7,3 és 7,4 közötti értékre állítjuk be, és 10—30 percig állni hagyjuk. Ezután ismét tömény hangyasawal a pH-t 40 6,3-ra állítjuk be, és hozzáadunk felényi térfogatú 0,4%-os (súly/térfogat) 2-etoxi-6,9-diamino-akridin-laktát oldatot. Félórányi állás után a csapadékot 4 C°-on, 45 perc alatt, 2500 g értéken lecentrifugáljuk. A csapadékból a hatóanyagot a szervkivo- 45 násra használt és literenként 29,8 g kálium-bromidot is tartalmazó pufferrel vonjuk ki, a hatóanyagkicsapás előtti oldattérfogat 1/4-részének megfelelő mennyiséggel. Az oldatlan maradékot 4 C°-on, 45 percig, 4200 g értéken centrifugálással elkülönít- 50 jük. A felülúszó oldatot a szervkivonásra használt pufferoldattal szemben 4 C°-on dializáljuk, majd liofilizáljuk. A kapott 15-hidroxi-prosztaglandin-dehidrogenáz súlya 3,0 g, fajlagos aktivitása 3 E/mg, összes termelés: 9000 E. 55 A kiadásért felel: a Közgazdasági 774058 - Zrín 3. példa 1,5 kg friss sertéstüdőt megtisztítás után felaprítunk, majd homogenizátorban tisztított szerv-kilogrammonként 2 liter, literenként 0,744 g etiléndiamin-tetraecetsav-dinátriumsót és 0,05% (térfogat/térfogat) merkapto-etanolt tartalmazó, 0,01 M töménységű, pH = 7,4 értékű foszfátpufferrel kivonatolunk. A kapott szuszpenziót 4 C°-on 45 percig centrifugáljuk 1500 g értéken, majd a felülúszót gézen átszűrjük. Ezután 2 N sósav hozzáadásával az oldat pH-ját 5,7 értékre állítjuk be, és a kiváló, ballasztanyagokat tartalmazó csapadékot 4 C°-on 25 percig végzett centrifugálással elkülönítjük. A felülúszó pH-ját 2 N nátronlúg segítségével 6,4-re állítjuk be, és 0,4 térfogatrésznyi 0,4%-os (súly/térfogat) 3,6-diamino-akridin-dihidroklorid („Pro flavin", Mann Research Laboratories, New York, USA) oldat hozzáadásával a hatóanyagot kicsapjuk. A kivált csapadékot 4 C°-on lecentrifugáljuk, és a csapadékból a hatóanyagot a szervkivonásra használt és literenként 29,8 g kálium-bromidot is tartalmazó pufferoldattal kivonatoljuk. 4C°-on 25 percen át 4000 g értéken végzett centrifugálás után a felülúszót a szervkivonásra használt pufferoldattal szemben 4C°-on dializáljuk, majd az oldatot fagyasztva szárítjuk. A kapott 15-hidroxi-prosztaglandin-dehidrogenáz súlya 1,5 g, fajlagos aktivitása 3 E/mg, termelés: 4500 E. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás 15-hidroxi-prosztaglandin-dehidrogenáz tisztítással egybekötött kinyerésére lúgos pH-jú pufferekkel készített sertés- vagy marhatüdő-kivonatokból, frakcionált kicsapással, a hatóanyagot tartalmazó csapadék kálium-bromid-tartalmú oldattal végzett kioldása és az elkülönített oldat vizes pufferoldattal szemben végzett dialízise, majd a dializáit oldatból a víz eltávolítása útján, azzal jellemezve, hogy a frakcionált kicsapást úgy hajtjuk végre, hogy a sertés- vagy marhatüdő-kivonat pH-értékét savval 5,0 és 5,9 közé, célszerűen 5,6 és 5,7 közé állítjuk be, a csapadékot eltávolítjuk, majd a tiszta oldat pH-értékét 6,0 és 6,5 közé, célszerűen 6,3 és 6,4 közé állítjuk be, és a hatóanyagot valamely diamino-akridin-vegyület, célszerűen 2-etoxi-6,9-diamino-akridin-laktat vagy 3,6-diamino-akridin-dihidroklorid hozzáadásával kicsapjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a kicsapásra használt diamino-akridin-vegyület végtöménységét 0,10 súly/ /térfogat% és 0,20 súly/térfogat% közötti értékre, célszerűen 0,13 súly/térfogat%-ra állítjuk be. ss Jogi Könyvkiadó igazgatója yi Nyomda 3