168902. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-triptofán és származékai folyamatos fermentációs előállítására
5 168902 6 indolt a sejtek igen gyorsan abszorbeálják, a sejtmentes fermentlé elemzésével kapott értékek nem adnak megfelelő információt. A túl nagy maradék indol-tartalmat jelző változásokat szabályozóként is felhasználhatjuk az indol-adagolás sebességének 5 csökkentésére és/vagy a vasadagolás növelésére és/vagy a levegőztetés sebességének fokozására. Annak megállapítására, hogy a vaskoncentráció nem haladja-e megy a triptofán bomlását előidéző 10 kritikus értéket, dextrángél-oszlopon (SephadexR ) ultraibolya fényben folyamatos elemzéseket végzünk, majd felvesszük a triptofán-frakciók ultraibolya abszorpciós spektrumát. Ezzel az elemzési módszerrel könnyen kimutathatók a triptofán bom- 15 lástermékei, elsősorban a kinurénsav. Megállapítottuk továbbá, hogy a felhasznált törzs triptofán-szintetizáló képességét nem korlátozza a visszacsatolási effektus. így körülbelül 15 g/l triptofán-koncentrációjú tenyészetek is készíthetők anélkül, 20 hogy a szintézis sebessége megváltozna. A fenti ismertetett eljárásban a triptofán-termelést az a körülmény is gátolja, hogy a mikroorganizmus szerin termelésére is képes. Kísérletekkel 25 kimutattuk, hogy a törzs indol-fogyasztása néhány pillanat alatt jelentősen fokozódik, ha a táptalajhoz szerint adunk. Minthogy a szerin túl költséges anyag ahhoz, hogy táptalaj-komponensként alkalmazzuk, a glicin 30 adagolásakor fellépő változásokat is tanulmányoztuk. Azt tapasztaltuk, hogy a glicin ugyanolyan hatást gyakorol a rendszerre, mint a szerin, a hatás azonban a beadagolást követő néhány óra elteltével jelentkezik. Az indolt viszonylag nagy 35 sebességgel táplálhatjuk be az 1—10 g/l glicint tartalmazó rendszerekbe. A képződött triptofánt ioncserés módszerrel különítjük el és tisztítjuk., Az ioncserére kerülő fer- 40 mentié lényegében sejtmentes. Ioncserélő gyantaként kevés keresztkötés tartalmazó, vagy ún. ,,makro-retikuláris" gyantákat alkalmazunk. A kezelendő fermentlevet 0,1 ágytérfogat/óra sebességgel áramoltatjuk át. Az oszlopot desztillált vízzel mossuk, 45 majd 50%-os etanollal és 50%-os 1 n ammóniaoldattal eluáljuk. A kapott triptofán-oldatot sósavval semlegesítjük, és így körülbelül 95%-os hozammal kapjuk a kristályos triptofánt. 50 A találmány szerinti eljárással kapott termék Streptomyces faecalis vizsgálati mikroorganizmussal szemben 100%-os biológiai hatásossággal rendelkezik. A termék Ehrlich- és ninhidrin-próbával kimutatható szennyezést nem tartalmaz. 55 A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 60 1. példa A fermentációt kis indol-betáplálási sebességgel nagy Fe2+ koncentráció fenntartásával végezzük egy Chemap GF 0014 gyártmányú, mechanikus 65 habeltávolítóval felszerelt fermentorban, az alábbi körülmények között: fordulatszám: 2000/perc, a táptalaj adagolási sebessége: 200 ml/óra, a hígítás sebessége: 4,1%, hőmérséklet: +26 C°. Táptalaj: 1 g indol 0,1 g p-amino-benzoesav 25 g élesztőkivonat 200 ml „A" oldat 200 ml „B" oldat 200 ml „C" oldat 1 kg glükóz (autoklávban külön előkezelt anyag) desztillált víz ad 10 liter pH: 5,5 „A" oldat: 3% CaCl2 • 2H 2 0 „B" oldat: 10% KH2 P0 4 „C" oldat: 5% MgS04 • 2H 2 0 0,125% vascitrát 0,015% MnS04 -4H 2 0 0,02% ZnS04 '7H 2 0 10% NaCl Levegőztetési sebesség: 80 liter levegő/óra x liter tenyészet. A táptalajt körülbelül 50 ml térfogatú, rázógépen tenyésztett 24 órás Candida humicola tenyészettel oltjuk be. A tenyésztés során a közeg pH-ját mintegy 6,5 értéken tartjuk, és a titrálást ammóniával végezzük. A tenyészetet 24 órán át inkubáljuk, majd beindítjuk a táptalaj és az indol adagolását. Az indolt a táptalajra vonatkoztatva 0,14 vegyes % sebességgel adagoljuk. A táptalaj vascitrát-koncentrációja 24 mg/l. Ilyen mennyiségű vascitrát jelenlétében a megadott indoladagolási sebesség esetén maradék indol nem mutatható ki. Az eljárással azonban triptofánt nem állíthatunk elő, mert a már kialakult triptofán azonnal bomlik (az elegyben többek között kinurénsav mutatható ki). 2. példa A fermentációt kis indol-adagolási sebesség és kis vaskoncentráció fenntartásával, az 1. példában leírt körülmények között végezzük. Táptalajként a következő összetételű közeget alkalmazzuk: NH4 C1 50 g niacin 0,5 g vascitrát 10 mg tiamin 50 mg „K" oldat 10 ml „A" oldat 100 ml ,3f" oldat 200 ml „Bk" oldat 200 ml „C" oldat 200 ml szacharóz lkg desztillált víz ad 10 liter 3
