168856. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-amino-2,2-dimetil-penam-3-karbonsavszármazékok előállítására kötött enzim alkalmazásával
7 1688S6 8 során a 6-APA kristályos alakban kicsapódik. A csapadékot vákuum-szűréssel összegyűjtjük, majd vákuumban súlyállandóságig szárítjuk 45C°-on és 0,5Hgmm nyomáson. így 32,4 g terméket kapunk. A 450 ml anyalúgot hidroxilaminos módszenei mérve azt találjuk, hogy az 180 mmól 6-APA-t tartalmaz literenként, mely mennyiség 0,39 súly%nak felel meg. A kapott kristályos 6-APA-t ismét feloldjuk vízben és hidroxilaminos módszerrel meghatározzuk. A terméket egy nagyon tiszta 6-APA standard oldatával összehasonlítva 98,5% hatóanyagtartalmat mutathatunk ki. így 161 mmól penicillinből kiindulva 32,4 x 0,985 = 147 mmól 6-APA-t 216 kapunk. Feltételezve, hogy a kiindulási anyag tiszta, a 6-APA teljes kitermelése 91,4% az elméletire vonatkoztatva. Folyamatos betáplálásnál a kristályosító vizet részben recirkuláltathatjuk, majd visszavezethetjük vákuumbepárlásra. Ily módon a termék teljes kitermelése az elméleti 95%-ára nő. 3. példa Az 1. példában leírt enzimes szálat tartalmazó oszlopot használva, ampicillint (6-[D-(-)-a-amino-fenilacetamido]-penicilün) állítunk elő. A G penicillintől és a fenilecetsavtól mentes, az 1. példa szerint végrehajtott hidrolízisből származó vizes oldatot, mely kb. 8,5 mg/ml 6-APA-t tartalmaz, 6 körüli pH-értékre állítjuk és D-a-amino-fenilacetamido-hidrobromidot adunk hozzá. (Végső koncentráció 18 mg/ml.) Ezt a vizes oldatot a 37 C°-on termosztált és pH 6 értéken tartott oszlopon átengedjük. 6—7 óra alatt az ampicillin szintézise 90%-os kitermeléssel végbemegy. 4. példa A 3. példában leírt módon dolgozva, de a D-a-amino-fenilacetamido-hidrobromid helyett DL-mandulasavamidot használva, 12 mg/ml koncentrációban és kb. 5,5 pH értéknél, 6 óra alatt az a-hidroxi-benzil-penicillin szintézise 90%-os kitermeléssel megy végbe. 5. példa Egy reaktorban, keverés közben 16 g etilcellulózt (Hercules gyártmány, N-200jelű) oldunk 184g tokióiban. Egy másik edényben enzimoldatot készítünk: E. coli ATCC 9647 nedves sejtjeinek 60g-ját ultrahanggal feltárjuk, centrifugáljuk, a felülúszót ammóniumszulfáttal kicsapjuk és a csapadékot 30 ml, 30% glicerintartalmú 0,01 mólos foszfátpuff erben oldjuk. Az így kapott enzimoldatot a polimeroldathoz adjuk. 5 A két fázis emulzióját 0 C°-on 30 percig történő erélyes keveréssel állítjuk elő. Az emulziót egy -6C°-on tartott olvasztótégelybe öntjük és a fonást N2 gázatmoszférában végezzük. A szálakat petroléterben 20 C°-on koaguláltatjuk. 0 30 g enzimes szálat használva és az 1. példában leírt módon dolgozva, minden 5 órában majdnem állandó mennyiségű 6-amino-penicillánsavat kapunk, melynek súlya esetenként 5,15 g. 6. példa 1 kg nitrocellulózt 6,9 kg n-butilacetát és 4,6 g 20 toluol elegyében oldunk. A polimeroldathoz 1,6 kg, az 1. példában megadott módon E. coliból előállított és 15 600 egység/g aktivitású penicillinaciláz vizes oldatát adjuk. Erős keveréssel emulziót képzünk, és az emulziót 500, 125 ju átmérőjű nyílást 25 tartalmazó szálképző fejen nyomjuk át. A polimert petroléter fürdőn átvezetve koaguláljuk, ily módon 2,6 g 7-es szálat kapunk. 37,5 liter G penicillin oldatot (4%-os, 0,1 m 30 foszfátpufferben, pH 8,0) keringtetünk egy 12x50 cm méretű, 1,5 kg 7-es szállal töltött oszlopon keresztül, 37 C° hőmérsékleten. A pH értéket nátriumhidroxidoldat hozzáadásával állandó 8,0 értéken tartjuk. 4 óra múlva konstans 95%-os hid-35 rolízisfokot érünk el, és a 6-APA-t elválasztjuk a reakcióelegyből. A kitermelés 88%, és ez 5 hónapon keresztül állandó marad. Nem a találmány tárgyához tartozó közlésként az alábbi eljárásokat ismertetjük hasonló enzim-készítmények előállí-40 tására. a) Az 5. példával -azonos módon dolgozva, egy analóg enzimkészítményt poli-y-metil-glutamátba foglalunk (PLG-30 Kjowa Hakko Kogyo Co. Ltd.). A koaguláltatást tokióiban végezzük azonos hőmér-45 sékleten. Ennek az enzimes szálnak 30 g-ját az 1. példában leírt módon használva, minden 5 órában 6 g 6-amino-penicillánsavaí kapunk. b) Az 1. példában megadottak szerint 100 g 50 nedves Penicillium chrysogenum sejtből nyert nyers enzimextraktumot tartalmazó szálas anyagot készítünk. Penicillium chrysogenum ATCC 10002 törzset tenyésztünk 25 C°-on 6 napon át dextróz-burgonya 55 agáron (Difco). A spórákkal a következő táptalajt oltjuk be: kukoricalekvár (szárazanyag) 25 g/l, szacharóz 20 g/l, kalciumkarbonát 5 g/l, Na2 S 2 0 3 • 5H 2 0, 0,2 g/l, pH 5,5. A beoltott táptalajt 3 napon át 25 C° hőmérsékleten rázatjuk. A 60 főfermentációt Jarvis-Johnson táptalajon (J. Bacterial. 59 51 [1950]) végezzük, 0,2% fentilecetsav hozzáadásával. A fermentáció végeztével a micéliumot centrifugálással elválasztjuk, és tízszeres térfogatú hideg acetonnal kezeljük. A keletkezett ace-65 ton száraz port kétszer pH 6,0 értékű 2 m nátrium-4
