168856. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-amino-2,2-dimetil-penam-3-karbonsavszármazékok előállítására kötött enzim alkalmazásával
9 168856 10 acetätpufferrel extraháljuk. Az extraktumot dializáljuk, vákuumban alacsony hőmérsékleten bepároljuk, majd az oldatot cellulóztriacetát szálak húzásánál használjuk. 30 g keletkezett enzimszálat az 1. példában megadott oszlopba töltünk, melyet 5 37 C° hőmérsékleten termosztálunk. Az oszlopon 600 ml 1%-os vizes V-penicülin-káliumsó oldatot vezetünk keresztül, miközben a pH-t 8,0 értéken tartjuk. 5 óra alatt 90%-os hidro- io lízíst érünk el. Az oszlopot hosszú ideig működtetve a szálas anyag teljes aktivitását megtartja. c) Bacillus megaterium ATCC 14945 törzset ferde agar lemezről a következő összetételű táp- 15 talajra oltunk: cukorrépa melasz: 50 g/l, NH4C1 10 g/l, KH2 P0 4 1,2 g/l, MgS0 4 6g/l, CaC0 3 10 g/l, kazeinhidrolizátum 0,2 g/l, pH 6,8. 30 C° hőmérsékleten 72 órán át végzett inku- 20 bálás után a szilárd alkotórészeket lecentrifugáljuk, és a sejtmentes felülúszóból kinyerjük az acilázt. A sejtmentes fermentlevet vákuumban bepároljuk, az enzimet ammóniumszulfáttal kicsapjuk, a csapadékot 0,01m foszfátpufferben (pH 7,0) kicsapjuk, 25 és ugyanazon pufferrel szemben dializáljuk. A kapott oldatot centrifugálással tisztítjuk, majd a szálhoz való kötésre használjuk. 200 literes fermentációból összesen 1,8 xlO6 egység (légy- 30 ség = 1 mmól 6-APA/őra 37 C° hőmérsékleten) acilázt kapunk és ezt 500 g cellulóztriacetát szálba ágyazzuk az 1. példában megadott eljárás szerint. A peniciffiaacilázt tartalmazó szál sorozatos 35 használat után (2%-os G-penicillin-oldat hidrolízisnél) sem veszít aktivitásából. d) Streptomyces ATCC 21138 ,törzset tenyésztünk a következő összetételű táptalajon: glükóz 20 g/l, szójaliszt 20 g/l, élesztőextraktum 5 g/l, nát- 40 riumklorid 5 g/l és CaC03 2 g/l, pH = 7,0. 25 C° hőmérsékleten 96 órán át végzett inkubálás után a micéliumot lecentrífugáljuk, vízzel mossuk és Mentor-Gaulin homogenizátoron mechanikusan összezúzzuk. A sejtanyagot elválasztjuk, és az enzimet a 45 felülúszóból ammóniumszulfáttal kicsapjuk. A csapadékot 0,05 m foszfátpufferben (pH = 6,5) felvesszük, dializáljuk, és az 5. példában megadott módon etilcellulózon kötjük meg. Ily módon 500 enzimegység/g polimer aktivitású szálat kapunk, so mellyel 0,5-1% V-penícillin oldatot hidrolizálunk. A 6-APA kitermelés 75% feletti, és még több hónapos használat után is 70% konverziót kaptunk. 55 Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás II általános képletű 6-amino-2,2-dimetil-penam-3-karbonsav-származékok vagy e vegyületek sóinak előállítására, kötött enzim alkalmazá- 60 sával, mely képletben X jelentése hidrogénatom, a-amino-fenü-{l—4 szénatomos)-alkilkarbonil- vagy a-hi dz oxi-f enil-(l —4 szénatomos)-alMlkarboníl-csoport, valamely í általános képletű 6-acii-amino-2,2--dimetil-penam-3-karbonsav származékból vagy vala- 65 mely sójából, mely képletben R jelentése fenil-(l-4szénatomos)-alkil- vagy fenoxi-(l-4 szénatomos)-alkil-csoport, azzal jellemezve, hogy az utóbbit egy szálra felvitt acilázkészítménnyel kezeljük, mely az enzimet Escherichia coli ATCC 9637 mikroorganizmusból nyert nyers extraktumok alakjában tartalmazza, és mely szálként észterezett cellulózpolimereket, cellulóznitrátokat, vagy poliolefineket tartalmaz, és kívánt esetben a keletkezett 6-amino-2,2-dimetil-penam-3-karbonsavat elválasztjuk, és/vagy kívánt esetben ugyanazzal a fent megadott szálak valamelyikével felvitt aciláz-készítménnyel kezeljük, egy a-amino-fenil-(l-5 szénatomos)-alkán-karbonsav vagy a-hidroxi-fenil-(l—5-szénatomos)-alkánkarbonsav vagy amidja jelenlétében. (Elsőbbsége: 1972. április 27.) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy olyan I általános képletű vegyületből indulunk ki, ahol R jelentése fenil-( 1-4 szénátomos)-alkil- vagy fenoximetilcsoport. (Elsőbbsége: 1971. április 28.) 3. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a hidrolízisre használt oldatban az I általános képletű vegyület koncentrációját 1 és 6 súly/térfogatszázalék közötti értékre állítjuk be. (Elsőbbsége: 1971. április 28.) 4. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a hidrolízisre használt oldatban az I általános képletű vegyület koncentrációját 2 és 3 súly/térfogatszázalék közötti értékre állítjuk be. (Elsőbbsége: 1971. április 28.) 5. A 2—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a hidrolízis során az oldat pH-ját 8 értéken tartjuk. (Elsőbbsége: 1971. április 28.) 6. A 2—5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az I általános képletű 6-acilamino-2,2-dimetii-penam-3-karbonsav -ahol R jelentése a fenti- oldatát a hidrolízistérbe pufferolva adagoljuk. (Elsőbbsége: 1971. április 28.) 7. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az acilezési reakcióban 1 és 3 súly/térfogatszázalék közötti koncentrációjú 6-amino-2,2-dimetil-penam-3-karbonsav-oldatot használunk. (Elsőbbsége: 1971. április 28.) 8. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az acilezés során a reakcióelegy pH-ját 6 értéken tartjuk. (Elsőbbsége: 1971. április 28.) 9. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja a-hidroxi-fenil-acetamido-2,2-dimetil-3-karbonsav előállítására, azzal jellemezve, hogy 6-amino-2,2-dimetil 3-karbonsavat és DL-mandulasavamidot kezelünk Escherichia coli sejtekbői nyert acilázt és cellulóztriacetát szálakat tartalmazó szálas enzimkészítménnyel. (Elsőbbsége: 1971. április 28.) 10. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítás módja 6-[D-(—}<K-amino-fenilacetamido]-2,2-dimetíl-3-karbonsav előállítására, azzá jellemezve, hogy 5
