168850. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hisztaminopexiás hatású glükoproteinek előállítására

15 168850 16 „C" táblázat folytatása F 947 a-amino N : 6,5% F 950 a-amino N : 7,4% Met 0,008 0,012 lie 0,109 0,076 Leu 0,230 0,140 Tyr 0,121 0,047 Phe 0,121 0,063 Lys 0,184 0,133 His 0,049 0,063 Arg 0,011 0,062 Pro 0,200 (? ) 0,166 (?) A táblázatból megállapítható, 2S — hogy az egyes aminosavak aránya igen tág határok között változik [Arg/His vagy Thr/Ser], — a cisztein aránya mintáról-mintára erősen változik, a változást azonban a hidrolízis során vég- 30 bement oxidáció is előidézhette, •-•— a- metionin-tartalom — a hidrolízis során végbement oxidáció következtében - valószínűleg szintén hibás, — a kromatogrammban jelentős mennyiségű 35 nem-standard aminosav vagy ninhidriddel reagáló termék található. A közvetlenül a valin után elhelyezkedő anyag galaktozamin vagy mannózamin lehet — ezek az anyagok megfelelnek a termék ozarmn-tartalmának, 40 — mivel nem állt rendelkezésre speciális koloriméter, amely segítségével a prolin-ninhidrin reakció révén létrejött színezéket ki lehetne értékelni, a prolin mennyisége nem tekinthető pontosnak. 45 III. A fizikokémiai vizsgálatok összefoglalása A találmány szerinti eljárással előállított termékek szennyeződést tartalmaznak. Ezt a szennye- 50 ződést az F 947 jelű terméknél albuminnal azonosítottuk. Mivel a szennyezés mennyisége igen csekély (mintegy 1 ezrelék), első közelítésben meg lehetett határozni a termékek jellemzőit. Az emberi eredetű protein molekulasúlya 55 110 000, protein-tartalma 56%. A proteinek aminosav-összetételét a „C" táblázat, cukor-rész összetételét a „B" táblázat tartalmazza. A két anyagtartalom összegezésekor létrejövő csekély többlet (3,5%) valószínűleg analitikai hiba következménye. 60 A disznóból származó protein esetében a molekulasúly 120 000 a termék protein-tartalma 42,8%, aminosavösszetétele a „C" táblázatban található. A cukor-rész összetételét — anyagminta hiányában — kevésbé pontosan határoztuk meg. 65 A két protein kismértékben különbözik egymástól, ugyanakkor szerkezetükben bizonyos hasonlóságok figyelhetők meg (különösen az aminosav-Összetételben). A két gyenge antigén-antitest reakció következtében nem zárható ki, hogy az amberi és a disznó eredetű glükoproteinek közös antigén-jellegű komponenssel rendelkeznek. Farmakológiai hatás Ismeretes, hogy tengerimalac izolált ileuma hisztamin jelenlétében rögzíti a glükoproteint. Vizsgáltuk, hogy a rögzítésnek a hisztamin jelenléte valóban feltétele-e. Kísérlet Ileumot 1 DMA/ml aktivitású glükoprotein-oldatba helyezünk (1. fürdő). Ezután az ileumot átvisszük 10 ml Tyrode-oldatba (2. fürdő) és alaposan átöblítjük. Megvizsgáljuk az 1. fürdő hisztamin-aktivitásának csökkenését: farmakológiai módszerrel nem állapítható meg az aktivitás csökkenése. Hasonló módon megvizsgáljuk a 2. fürdőt is: . ebben az esetben 15—20%-os .aktivitás-csökkenés tapasztalható. (A DMA egység a termék minimáis aktív dózisának felel meg). Megállapítható tehát, hogy a glükoprotein hisz- j tamin nélkül kötődik az ileumhoz. A DMA érték megfelel az alkalmazott protein-mennyiségnek. (A biológiai hatás 20%-os csökkenése megfelel a DMA-értéknek, a 2. fürdő 15-20%-os aktivitás-csökkenése a kezelés során fellépő anyagveszteségnek tudható be.) Megállapítható tehát, hogy a glükoprotein az ileummal érintkezésbe kerülve nem változtatja meg farmakológiai tulajdonságait. Ennek következtében pontosan meghatározhatók a glükoprotein rögzítési és deszorbeálódási körülményei és a hisztamin jelenlétének vagy hiányának hatása. Az ileumot ezután 1 DMA/ml koncentrációjú glükoproteinoldattal és 0,2nM hisztamin-oldattal hozzuk érintkezésbe (1. fürdő). Az ileumot ezután 0,2nM/ml hisztamint tartalmazó Tyrode-oldattal (2. fürdő) mossuk. Az ileumot másodszor hisztamint nem tartalmazó 5 ml Tyrode-oldattal (3. fürdővel) mossuk. A fenti kezelések után meghatározzuk a fürdők farmakológiai aktivitását. Az 1. és 2. fürdő nem csökkenti a hisztamin biológiai hatását, a 3. fürdő hisztamin-aktivitása azonban 20%-kal csökken. A glükoprotein a hisztamin jelenlétében tehát megkötődött az ileumon és a hisztamint tartalmazó Tyrode-oldattal történő mosás után is abszorbeálva maradt. A hisztamin nélküli oldattal végzett mosás során azonban a glükoprotein deszorpbeálódott, ez a deszorpció kvantitatív volt, mivel a hisztamin hatáscsökkenése maximális (20%) volt. 8