168850. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hisztaminopexiás hatású glükoproteinek előállítására
168850 8 '3 -*-> C «> .3 o N K3 «:2 e 3 3 o as 2 "a 2 £ N S -M 0) o <=> 3 6 o tit kr kapo 'S3 •e '0> r* 03 nt (H *cfl u e9 w 2 3 Disznószérum glükoproteinek súly vagy térfogat 12,5 liter proteinsúly 1037g x(ng) 13,7 • 103 1/x (E)mg/ 73 P/x 7,5 • 107 A táblázatban 300 mg 140 mg 0,1 107 Meggyőződtünk róla, hogy a felülúszóból kivett aliquot rész nem ad csapadékot fitinsawal, majd az elegyet 24 órán keresztül +4C°-on állni hagyjuk. A csapadékot szűréssel vagy centrifugálással kü-5 lönítjük el. A felülúszó fázis pH-ját kb. _2n nátriumhidroxid-oldattal 6-ra állítjuk be, a feleslegben levő fitinsavat dialízissel távolítjuk el. 10 c) AMICON XM 100A membránnal végzett dialízis A műveletet 2 liter térfogatú cellában hajtjuk végre (2 000 számú Amicon-cella). A cellát 10 15 literes tartállyal kötjük össze. A 10 liter térfogatú fitinsavas felülúszó fázist kb. 100 liter sómentesített vízzel szemben dializáljuk 0,7 atm nyomás alatt. 20 A művelet után a protein-oldatot ugyanebben a cellában ultraszűrésnek vetjük alá és így 200ml-re betöményítjük. 140 • 107 A koncentrátumot liofilizálva 8,20 g port ka-25 punk. x a frakcióban jelenlevő hisztaminopexiás hatású protein súlyát jelenti, 1/x a protein milligrammnyi súlyában jelenlevő egységek számát adja meg, P/x a mintában levő hisztaminopexiás egységek számával egyenlő. d) Karboximetilcellulózzal végzett kromatografálás 30 2. példa Hisztaminopexiás hatású glükoproteinek előállítása humán szérumból, a) Ammóniumszulfáttal történő kisózás A szérumot 20 liter 4,5 ezrelék koncentrációjú nátriumklorid-oldatban oldjuk, majd az alábbi három ammóniumszulfátoldattal kezeljük: 0-1,9 mólos ammóniumszulfát-oldat, pH = 7 1,9-2,4 mólos ammóniumszulfát-oldat, pH = 7 2,4-3,3 mólos ammóniumszulfát-oldat, pH = 7 A legutolsó frakció csapadékát feloldjuk 8 ezrelék töménységű nátriumklorid-oldatban és gyakran cserélt sómentesített vízzel szemben dializáljuk. A dializálást az ammóniumszulfát lehető legtökéletesebb eltávolítása céljából megismételjük, ez a só ugyanis a következő lépés eredményét különösen károsan befolyásolja. Az ismertetett előduzzasztott CMC 52 ioncserélőt alkalmazzuk. A terméket 0,1 mólos 4,2 pH-jú pufferrel kiegyensúlyozzuk, a finom részecskéket eltávolítjuk, majd a karboximetilcellulózt 35 ml átmérőjű, 60 cm hosszú oszlopba töltjük be. Az 35 oszlop mindkét végén porózus lemezzel és dugattyúval van elzárva. A proteinmintát 4 g/100 ml arányban 4,2 pH-jú, 0,1 mólos töménységű pufferben oldjuk, 48 órán 40 keresztül ugyanebben a pufferben dializáljuk, majd centrifugáljuk. Az oszlopba a centrifugálás során kapott felülúszót visszük be adagolószivattyú segítségével 15 ml/óra • cm2 sebességgel (azaz óránként 120 ml-es sebességgel). 45 A kolonnából kifolyó eluátumot Uvicord II LKB fotométer és ezzel összekapcsolt LKB regisztrálóberendezés felhasználásával 280nm-nél értékeljük ki. Az eluciót egymás után a következő 50 pufferekkel végezzük: 4,2 pH-jú, 0,1 mólos puffer 4,8 pH-jú, 0,1 mólos puffer 0,025 mól nátriumhidroxid-oldat. 55 b) Fitinsavas kicsapás A kisózással kapott termék térfogata 1 liter, proteinkoncentrációja 65 ezrelék. A közeget 3 liter sómentesített vízzel hígítjuk, kb. 2n sósavval 2,10-ig savanyítjuk, majd keverés közben lassan 6 liter 2,10 pH-jú 0,1 n fitinsavoldattal elegyítjük. Az eluátumot frakciószedővel gyűjtjük össze, az egyesített frakciókat sómentesített vízzel szemben dializáljuk, betöményítjük és liofilizáljuk. 60 Az első frakció 720 mg por-formájú keresett proteint tartalmaz. összehasonlítás céljából karboximetilcellulóz gélen kromatografáltuk az XM 100A membránon dialjzált terméket és az XM 300 membránon diali-65 zált terméket. 4
