168850. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hisztaminopexiás hatású glükoproteinek előállítására

9 168850 10 Kapott eredmények Farmakológiai hatás: Azt találtuk, hogy a kívánt hatással csak az oszlopon meg nem kötött (a 4,2 pH-jú, 0,1 mólos pufferrel eluált) frakció rendelkezik. Az alábbi táblázatban megadjuk a különböző minták aktivitását a karboximetilcellulóz-oszlopon végzett kromatografálás eló'tt és után: ö o x3 M N 'S -o s 2 3 CD Ö) 8 •to O 2 C5 N rS b ~ b ~ o -s; co S •H 3 -a a 3 '3 +-> "3 o t-i *03 2 3 Humán szérum glükoproteinek por súlya 500 g. 720 mg. proteinsúly (biuret) 350 g. 403 mg. x(ng) 2-10'3 0,1 1/x (E)mg/ 500 107 P/x 17,5 17,5-107 403 • 107 A táblázatból látható, hogy az elkülönítési művelettel mintegy 20 000-szeres dúsítást és 23-szoros aktivitásnövekedést biztosítottunk. (A dúsítás az egységek aktivitásértékéből, a dúsítás a mg proteinben jelenlevő egységek számának összehasonlításával állapítható meg.) A termék fizikokémiai vizsgálata: A 2. példa szerinti humán szérumból előállított glükoproteint a továbbiakban F 947 kísérleti jellel, az 1. példa első eljárása szerint disznó szérumból kiindulva készített terméket F 950, a második eljárással előállított anyagot F 952 kísérleti számmal jelöljük. I. Tisztasági kritériumok a) Elektroforézis Az elektroforézist 8,6 pH-nál, veronál puffer jelenlétében, cellulóz-acetát felhasználásával hajtottuk végre. A futtatás ideje 3/4 óra volt, a potenciálkülönbség 200 Voltot tett ki. A termékeket amidoschwartz színezékkel még túladagolással sem lehetett előhívni. A terméket megpróbáltuk az amidoschwartz-nál 5-ször érzékenyebb Comassie Blue színezékkel kimutatni (1%-os oldat formájában), ennek segítségével albumin-mozgékonysággal rendelkező anyagot találtunk. Schiff-reagens periodikus oxidációjával és a szín 5 előhívásával megállapítottuk, hogy az albumin-mozgékonyságú protein glükoprotein. b) Immunelektroforézis 10 Az immunelektroforézist agaróz-gélen hajtottuk végre, 8,2 pH-jú veronál-puffer felhasználásával. A művelet ideje 1 óra 15 perc volt, a potenciálkülönbség 280 Voltot tett ki. 15 1) F 947 jelű termék A termék teljes humán immunszérum antiszérummal albumin-szinten nehezen észrevehető csapadékfázist ad. 20 A termék humán antialbumin antiszérummal rendkívül diffúz fázist képez, amelyet sem elszínteleníteni nem lehet, sem egyértelműen csapadéknak nem lehet minősíteni. Anti-IgG szérummal a termék nem képez csa-25 padékfázist. 2) F 950 jelű termék A disznóból kipreparált terméket teljes disznó 30 antiszérum immunszérummal futtatva az albumin-szintnél csapadék-fázisra utaló zavarosodás jelentkezik. c) Poliakrilamid-gél 35 A termékeket teljes humán szérum összehasonlító anyag jelenlétében poliakrilamid-gélen migráltatva az F 947 és F 950 preparátumoknál albumin-mozgékonyságú sáv állapítható meg. A gélt a 40 nagyobb érzékenység biztosítására „Comassie blue" színezékkel hívtuk elő. d) Koncentrációgrádiens-gél 45 A fentiek szerint előállított hisztaminopexiás hatású glükoproteinek molekulasúlyát megkíséreltük pontosabban is megállapítani. A koncentrációgrádiens-gélben végzett futtatás során a katód elmozdul az anód, azaz a migráció irányában és így 50 a molekulák a legnagyobb hézagméretű gél-részektől a kisebb hézagméretek felé tartanak. összehasonlítás céljából alkalmazott tiszta humán albumin (Behring) 55 A sávok a nagyobb sávok felé haladva egyre jobban elkülönülnek egymástól. A grafikus rögzítés szerint a különböző polimerek csökkenő molekulasúly szerint helyezkednek el, a sor végén a 60 69 000-es molekulasúlyú monomer foglal helyet. F 947 jelű termék -kis intenzitású sáv a monomer-albumin szint-65 jén, valószínűleg albumin-szennyeződés. 5