168778. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gentamicin-tipusú antibiotikumok előállítására
19 168778 20 sorrendben 25—25 liter 0,05 n, 0,10 n, 0,12 n, 0,14 n, 0,16 n és 0,18 n 0,20, majd 1001. 0,25 n ammóniumhidroxid-oldattal végezzük 5 liter/óra sebességgel. 2500 mles eluátum frakciókat szedünk, majd a biológiai értékmérés és papír- és rétegkromatográíiás ellenőrzés után azokat a frakciókat, amelyek a gentamicin-A-t, ill. -B-t ill. -X-t ills sziszomicint tartalmazzák, egyesítjük. Az így kapott oldatokat vákuumban szárazra pároljuk, majd a szilárd maradékot benzol-etanol eleggyel vízmentesítjük. A szilárd maradékokat vákuumban 80 C°-on foszforpentoxid és szilárd káliumhidroxid felett 24 órán át szárítjuk. A kapott anyagok mennyiségét és összetételét a következő táblázat tartalmazza: Frakciószám Súly (g) Összetétel 5—25 20,1 szennyezések 26—27 0,8 gentamicin-X + szennyezések 28—33 3,8 gentamicin-A + szennyezések 34—40 19,2 gentamicin-A 41—48 8,9 szennyezések 49—53 7,8 gentamicin-B 54—63 12,4 gentamicin-Bj + szennyezések 64—69 12,2 sziszomicin 70—102 192,2 gentamicin-C komplex 4. lépés: gentamicin-X élőállítása A 3. lépésben kapott 26—27. frakciókból származó 0,8 g anyagot feloldjuk 2 ml vízben, és az oldatot 50 ml Dowex IX 2 (OH-) 200—400 mesh gyantát tartalmazó oszlopra Visszük, majd ionmentes desztillált vízzel 5 ml/óra sebességgel eluáljuk. 5—5 ml-es frakciókat véve a 6—7. frakciókat egyesítjük, majd szárazra pároljuk, és így 0,32 g gentamicin-X-t kapunk. Biológiai hatékonysága 25 E/ml. NMR színképét a 4. ábra szemlélteti. 5. lépés: gentamicin-A előállítása aj A 3. lépésben kapott 34—40. frakciókból származó 10 g anyagot feloldjuk 60 ml desztillált Vízben, és a kapott oldatot 1600 ml CM-Sephadex C—25 (NHj[) ioncserélő dextrán-gélt tartalmazó oszlopon (0 =5,0 cm, h = 82 cm) kromatografáljuk. Az eluálásra sorrendben 6—6 liter 0,10 n, 0,12 n és 0,14 n ammóniumhidroxid-oldatot alkalmazunk. 500 ml-es frakciókat szedve a 18—25. frakciókból, melyek tisztán gentamicin-A-t tartalmaznak, vákuum-bepárlás és szárítás után 7,95 g gentamicin-A bázist kapunk. Biológiai hatékonysága: 8 E/mg (gentamicin-C standard). NMR színképét az 1. ábra szemlélteti. b) A 3. lépésben kapott 34—40. frakciókból származó 9 g anyagot feloldjuk 55 ml vízben, és 800 ml Amberlite XE—69 (NHJ) 400 mesh gyantát tartalmazó oszlopon (0=3 cm, h = 114 cm) kromatografáljuk 30 ml/óra sebességgel. A gentamicin-A léoldását 1—1 liter 0,08 n, 0,11 n, 0,14 n és 0,16 n ammóniumhidroxiddal végezzük. 100 ml-es frakciókat szedve a 28—38. frakciókból bepárlás után 7,3 g gentamicin-A-t kapunk. Biológiai hatékonysága: 9 E/mg (gentamicin-C standard). 6. lépés: gentamicin-B előállítása A 3. lépés szerint kapott 49—53. frakciókból származó 7,8 g anyagot feloldjuk 50 ml desztillált vízben, majd 750 ml Amberlite IRP—64 (NHJ) mesh gyantát tartalmazó oszlopon (0 = 3,2 cm, h = 64 cm) kromatografáljuk 80 ml/óra sebességgel. Az eluálást 1—1 liter 0,10 n, 0,125 n, 0,15 n és 0,175 n ammóniumhidroxid oldattal végezzük. A 28—33-as frakciókból, amelyek a gentarnicin-B-t tartalmazzák, bepárlás után 6,0 g szilárd 5 terméket kapunk. Biológiai hatékonysága 580 E/mg (gentamicin-C standard). NMR színképét a 2. ábra szemlélteti. 7. lépés: gentamicin-Bl előállítása A 3. lépés szerint kapott 54—63. frakciókból szár-10 mázó 12,0 g anyagot feloldunk 40 ml ionmentes vízbenés800 ml Dowex—1X2(OH-) 200—400 mesh gyantát tartalmazó oszlopra (0=3 cm, h = 114 cm) viszszük, majd ionmentes vízzel eluáljuk 40 ml/óra sebességgel. 50 ml-es frakciókat véve a gentamicin-Bj-et tar-15 talmazó 10—16. frakciókat egyesítjük és vákuumban szárazra pároljuk. A kapott 10,7 g anyagot, mely még 12% gentamicin-B-t tartalmaz, feloldjuk 100 ml desztillált vízben és ezt az oldatot 1600 ml CM-Sephadex C—25 (NHJ) ioncserélő dextrán-gélt tartalmazó osz-20 lopon (0 = 5,0 cm, h = 82 cm) kromatografáljuk. Az eluálásra sorrendben 5—5 liter 0,12, 0,14 és 0,16 n ammóniumhidroxid oldatot alkalmazunk. A leoldási sebesség 120 ml/óra. 250 ml-es eluátum frakciókat véve a tisztán gentamicin-B^et tartalmazó 36—38. frakciókat 25 egyesítve vákuumban szárazra pároljuk. Ily módon 6,6 g gentamicin-Br et kapunk. Biológiai hatékonysága 480 E/mg (gentamicin-C standard). NMR színképét a 3. ábra szemlélteti. 8. lépés: sziszomicin előállítása 30 A 3. lépésben kapott 64—69. frakciókat, melyek a sziszomicint tartalmazzák, vákuumban 60—70 C°-on szárazra pároljuk, a víznyomokat benzol és etanol 1: 1 arányú elegyével eltávolítjuk, és a bepárlás után kapott maradékot vákuumban foszforpentoxid felett 35 60 C°-on súlyállandóságig szárítjuk. Hófehér amorf pór alakjában 10,8 g 88% tisztaságú sziszomicint kapunk. Optikai forgatóképessége: («)??= +178° (1%, víz). Ezt az anyagot feloldjuk 100 ml ionmentes vízben, és megkötjük 2000 ml ammónium-formájú CM-40 -Sephadex C—25 dextrán-gélt tartalmazó oszlopon (0 =5 cm, h = 102 cm). A gélt 200 ml desztillált vízzel átmossuk, majd a sziszomicin léoldását 0,1—0,3 h ammóniumhidroxid koncentráció tartományban gradiens elúcióval végezzük, 2 ml/perc sebességgel. 20—20 45 ml-es frakciókat szedve, a sziszomicint tartalmazó 128—152. frakciókat egyesítjük, vákuumban szárazra pároljuk, majd benzol és éter 1: 1 arányú elegyével vízmentesítjük. Vákuumban foszforpentoxid felett súlyállandóságig szárítva 7,15 g sziszomicint kapunk. Bio-50 lógiai hatékonysága 1680 E/mg: optikai forgatóképessége: (a£°= +188° (1%, víz). NMR színképét az 5. ábra szemlélteti. 9. lépés: gént amicin C komplex előállítása A 3. lépésben kapott 70—102. frakciókból származó 55 192,2 g anyagot (gentamicin C komplex, 995 E/mg, [a&5 = +158°) feloldjuk 2000 ml széndioxidmentes desztillált vízben. Az oldat pH-ját állandó keverés és hűtés közben 5 n kénsavval 4,5-re állítjuk be, majd az elegyhez 30 g aktív szenet (Norit A) adunk és 30 percig 60 nitrogénáramban keverjük. Az oldatot steril körülmények között Seitz lapon leszűrjük, a szűrőt 2 X 100 ml vízzel átmossuk és az egyesített szűrletet 20 liter metanolba öntjük. A kivált gentamicin C szulfát-sót 4 C°-on történő 12 órás állás után leszűrjük, 2 liter me-65 tanollal mossuk, majd vákuumban (3 Hgmm) 75 C°-on 10
