168696. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új noapeptidamid-származékok előállítására
25 168696 26 hat óra hosszat, majd szobahőmérsékleten 10 órán át keverjük. A reakcióelegyből kiszűrjük a keletkezett DC-karbamidot, és a szűrletet csökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékot minimális mennyiségű 10%-os vizes etanolban oldjuk, Amberlite XAD-2 oszlopra visszük fel és 10%-os vizes etanol-vízmentes etanol lineáris gradiensű rendszerrel eluáljuk. A főfrakciókat (48—66% etanolkoncentráció) egyesítjük és bepárlással töményítjük, majd liofilizálva 0,106 súlyrész H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-GIy-Met-Arg(N02)-Pro-NHC 2 H 5 -öt kapunk. 0,1 súlyrész fenti terméket 0,02 térfogatrész anizol, 0,02 térfogatrész 2-merkapto-etanol és 6 térfogatrész hidrogénfluorid elegyében oldunk és az elegyet — 10 °C hőmérsékleten egy órán át keverjük. A hidrogénfluoridot ezután csökkentett nyomáson lepároljuk és a maradékot exszikkátorban szárítjuk. A szárított maradékot 20 térfogatrész vízben oldjuk és Amberlite CG-400 (acetát ciklus) oszlopon vezetjük át. Az oszlopról lejövő oldatot liofilizáljuk, a maradékot 20 térfogatrész vízben oldjuk, és 0,4 térfogatrész tioglikolsavat adunk hozzá. Az elegyet 10 órán át 60 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. A reakcióelegyet 50 térfogatrész vízzel hígítjuk, karboximetilcellulóz oszlopon abszorbeáljuk és 0,005 n ammóniumacetát-0,2 n ammóniumacetát (400—400 ml) lineáris gradiensű rendszerrel eluáljuk. A terméket tartalmazó főfrakciókat (170—240 ml) egyesítjük és liofilizálás után 0,04 súlyrész kívánt terméket kapunk. A terméket 2 térfogatrész 0,2 n yizes ecetsavoldatban oldjuk és Sephadex LH-20 oszlopon engedjük át. Az elfolyó oldatot liofilizálva kapjuk a tiszta terméket. [OC]D = —62,4° (c ==0,14, 5%-osecetsavban), Rf 3 =0,36. Aminosavelemzés: His 0,98 (1); Arg 0,92 (1); Trp 0,88 (1); Ser 0,79 (1); Glu 1,00 (1); Pro 1,04 (1); Gly 1,00 (1); Met 0,92 (1); Phe 0,97 (1); NH2C 2 H 5 0,98 (1). A zárójelben álló számok az elmélet értékeket jelölik. 14. példa H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NH(CH2)2CH3 előállítása a) Z-Leu-Arg(N02)-Pro-OMe készítése 30 súlyrész Z-Arg(N02)-Pro-OCH3 -t oldunk 100 térfogatrész 25%-os HBr-ecetsav elegyben, az oldatot 30 percen át állni hagyjuk, majd vízmentes étert adunk hozzá. A kivált csapadékot leszűrjük, éterrel alaposan mossuk és szárítva kapjuk az aminkomponenst. Ezt 200 térfogatrész dioxánban oldjuk, 16,8 súlyrész Z-Leu-Osuval együtt, majd hűtés közben 18 térfogatrész trietilamint is adagolunk. Az elegyet egy éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük, majd az oldószert lepároljuk és a maradékot etilacetáttal extraháljuk és vízzel mossuk. Az etilacetátos fázist vízmentes nátriumszulfát felett szárítjuk majd az oldószert lepároljuk. A maradékot éterrel triturálva port kapunk, melyet leszűrünk és metanol-éter elegyből átcsapunk, kitermelés 30 súlyrész kívánt termék; op.: 105—107 °C; Rf 1 =0,53; [a]£ = -65,5° (c =0,5, etanolban). Elemzés a C26 H 39 0 8 N 7 képlet alapján: számított: C= 54,06, H=6,81, N = 16,98; talált: C =53,77, H=6,91, N = 16,88. b) Z-Leu-Arg(N02)-Pro-OH készítése 26,5 súlyrész Z-Leu-ArgíNO^-Pro-OCHj-t 100 térfogatrész metanolban oldunk, majd hűtés közben 60 térfogatrész 1 n nátriumhidroxid-oldatot adunk hozzá. Szobahőmérsékleten 1,5 órán át történő keverés után az oldószert lepároljuk és a keletkezett csapadékot etil-5 acetáttal extraháljuk. Az extraktumot vízzel alaposan mossuk és vízmentes nátriumszulfát felett szárítjuk. Az etilacetátot lepároljuk és a maradékot éterrel triturálva csapadékot kapunk, melyet leszűrünk és etanol-éter elegyből átcsapva tisztítunk. Kitermelés 21,8 súlyrész 10 kívánt termék; op.: 113—117 °C; [aß 2 = -55,5° (c = 1,0, etanolban); Rf 1 =0,39. Elemzés a C25 H 37 O g N 7 • 0,5 H2 0 képlet alapján: számított: C = 52,44, H =6,69, N = 17,12; talált: C = 52,74, H=6,83, N = 16,95. 15 c) Z-Leu-Arg(N02 )-Pro-NH(CH2) 2 CH 3 készítése 1,12 súlyrész Z-Leu-ArgíNO^-Pro-OH és 0,43 súlyrész HONBI10 térfogatrész DMF-el készített oldatához 0 °C hőmérsékleten 0,495 súlyrész DCC-t adunk. Az elegyet 4 órán át 0 °C hőmérsékleten keverjük. A keletke-20 zett DC-karbamidot kiszűrjük, és a szüriethez 0,12 súlyrész n-propilamint adunk. Az elegyet egy éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután az oldószert lepároljuk és a maradékot kloroformban oldjuk. A kloroformot vízzel mossuk, vízmentes magnéziumszulfát 25 felett szárítjuk és a szárított oldat bepárlása után szilárd anyagot kapunk, melyet szűréssel elválasztunk és etanol-éter elegyből átcsapva tisztítunk. Kitermelés 0,92 súlyrész; Rf 1 =0,60; op.: 140—142 °C;[a]g= -56,1° (c = 1,0, etanolban). 30 Elemzés a C28 H 44 0 7 N 8 képlet alapján: számított: C = 55,61, H=7,33, N = 18,53; talált: C =55,63, H=7,56, N = 18,58. d) H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Arg-Pro-NH(CH2)2CH 3 készítése 35 2 térfogatrész 25%-os HBr-ecetsav elegyben 0,133 súlyrész Z-Leu-Arg(N02 )-Pro-NH(CH 2 ) 2 CH 3 -t oldunk és az oldatot 30 percig szobahőmérsékleten tartjuk. Ezután vízmentes étert adunk hozzá és a keletkezett csapadékot leszűrjük, majd nátriumhidroxid felett csök-40 kentett nyomáson exszikkátorban szárítjuk. A szárított port 2 térfogatrész DMF-ben oldjuk 0,04 térfogatrész N-etil-morfolinnal együtt. Ehhez az oldathoz 0,15 súlyrész H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH hidrokloridot majd 0,043 súlyrész 45 HONBI-t és 0,05 súlyrész DCC-t adunk hűtés közben. Az elegyet 2 órán át 0 °C hőmérsékleten, majd további 16 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A keletkezett -DC-karbamidot kiszűrjük és a DMF-t ledesztilláljuk. A maradékot etilacetáttal kezelve 0,25 súlyrész port 50 kapunk. A terméket Amberlite XAD-2 oszlopra visszük fel és 5%-os vizes etanol-vízmentes etanol lineáris gradiensű rendszerrel eluáljuk. A kívánt terméket tartalmazó főfrakciókat (50—68% etanol koncentráció) bepároljuk, majd liofilizálva 0,082 súlyrész tiszta védett 55 nonapeptidamidot kapunk. A terméket 5 térfogatrész hidrogénfluoridban 0,02 térfogatrész anizol és 0,02 térfogatrész 2-merkapto-etanol jelenlétében oldjuk és az elegyet — 5 °C hőmérsékleten egy órán át keverjük. A hidrogénfluoridot ledesztilláljuk és a maradékot szá-60 rítás után minimális mennyiségű vízben oldjuk. Az oldatot Amberlite IRA-400 (acetát ciklus) oszlopon engedjük át és az elfolyó oldatot 1,0, 30 cm méretű karboximetilcellulóz-oszlopra visszük fel. Az oszlopot 0,005 n vizes ammóniumacetát-0,2 n vizes ammóniumacetát 65 (200—200 ml) lineáris gradiensű rendszerrel eluáljuk és a 13
