168696. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új noapeptidamid-származékok előállítására
168696 21 22 9. példa H-(Pyr)GIu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-VaI-Arg-Pro-NHC2H 5 előállítása a) Z-VaI-Arg(N02)-Pro-NHC2 H 5 készítése 5 súlyrész 25%-os HBr-ecetsav elegyben 0,48 súlyrész Z-Arg-(N02)-Pro-NHC 2 H 5 -Öt oldunk és az oldatot 40 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután a reakcióelegyhez 50 súlyrész vízmentes étert adunk és a keletkezett csapadékot leszűrjük, vízmentes éterrel alaposan mossuk, nátriumhidroxid felett szárítjuk csökkentett nyomáson. A szárazport 0,20 súlyrész trietilamínnal és 0,49 súlyrész Z-Val-ONBI-vel együtt szobahőmérsékleten egy térfogatrész DMF-ben oldjuk. Az oldatot 6 órán át keverjük, az oldószert ezután lepároljuk és a maradékot 80 térfogatrész kloroformmal extraháljuk. Az extraktumot 5%-os vizes nátriumhidrogénkarbonát-oldattal, vízzel, 0,5 n sósavval és ismét vízzel mossuk. A mosott oldatot azután vízmentes magnéziumszulfát felett szárítjuk, a kloroformot ledesztilláljuk és a maradékot éterrel triturálva por keletkezik, melyet leszűrünk. A kitermelés 0,49 súlyrész; [x]%= -52,0° (c = l, metanolban), Rf 1=0,38. Elemzés a C26 H 40 O 7 N 8 képlet alapján: számított: C =54,15, H=7,02, N =20,53; talált: C =54,28, H=7,22, N = 19,17. b) H-(Pyr)GIu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Val-Arg-Pro-NHC2H 5 készítése 3 súlyrész 25%-os HBr-ecetsav elegyben 0,17 súlyrész Z-Val-Arg(N02)-Pro-NHC 2 H 5 -öt oldunk és az oldatot 30 percen át szobahőmérsékleten keverjük. A reakcióelegyet ezután száraz éterrel hígítjuk, mikoris fehér csapadék válik ki, melyet szűrünk és nátriumhidroxid felett csökkentett nyomáson szárítunk. A száraz port 3 súlyrész DMF-ben oldjuk, 0,19 súlyrész H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-hidrokloriddal és 0,10 súlyrész N-etil-morfolinnal együtt. A kapott elegyhez 0,055 súlyrész HONBI-t adunk és 0 °C-ra hűtjük. A Iehűtött oldathoz 0,063 súlyrészt DCC-t adunk keverés közben. Az elegyet 0 °C hőmérsékleten 3 órán át keverjük, majd a keverést szobahőmérsékleten 24 órán át folytatjuk. A keletkezett DC-karbamidot leszűrjük, és a szűrletet csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot minimális térfogatú 5%-os vizes etanolban oldjuk és az oldatot Amberlite XAD-2 oszlopra visszük fel és 5%-os vizes etanol-vízmentes etanol lineáris gradiensű rendszerrel eluáljuk. A peptidet tartalmazó főfrakciókat szárazra párolva 0,202 súlyrész tiszta védett peptidet kapunk. 0,1 súlyrész védett peptidet 80 °C hőmérsékleten 8 súlyrész 60%-os vizes hangyasavban oldunk. Az oldathoz 0,3 súlyrész ón(II)-kIorid-monohidrátot adunk és az elegyet 80—85 °C hőmérsékleten 2 órán át keverjük. Ezután az oldószert lepároljuk, és a keletkezett maradékot 5 súlyrész vízben oldjuk. Az oldatot 24 órán át hűtőszobában tartjuk, majd a keletkezett csapadékot leszűrjük és a szűrletet Amberlite XAD-2 oszlopra visszük fel és víz- 60%-os vizes etanol lineáris gradiensű rendszerrel eluáljuk. A kívánt terméket tartalmazó főfrakciókat egyesítjük és szárazra pároljuk. A keletkezett maradékot ezután karboximetilcellulózzal töltött oszlopra visszük fel. Az oszlopot 0,005 n vizes ammóniumacetát-0,2 n vizes ammóniumacetát lineáris gradiensű rendszerrel eluáljuk és a kívánt terméket tartalmazó főfrakciókat liofilizáljuk. Ily módon 0,077 súlyrész tiszta peptidet kapunk; [x]$= -52,5° (c = 0,5, 5%-os ecetsavban), Rf 3=0,35. Aminosavelemzés: His 0,93 (1); Arg 0,99 (1); Ser 0,94 (1); Glu 0,99 (1); Pro 1,01 (1); Gly 0,98 (1); Val 5 0,97 (1); Tyr 0,97 (1); NH2C 2 H 5 1,04 (1). A zárójelben megadott számok az elméleti értékeket jelölik. 10 10. példa H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Nva-Arg-Pro-NHC2H 5 előállítása a) Z-Nva-Arg(N02)-Pro-NHC2 H 5 készítése 15 10 súlyrész 25%-os HBr-ecetsav elegyben 0,96 súlyrész Z-ArgíNO^-Pro-NHCy^-öt oldunk és az oldatot 50 percen át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az oldathoz 100 súlyrész vízmentes étert adunk, és a keletkezett csapadékot leszűrjük, vízmentes éterrel alaposan mossuk 20 és nátriumhidroxid felett csökkentett nyomáson szárítjuk. A szárított port 2 súlyrész DMF-ben oldjuk, 0,35 térfogatrész trietilaminnal együtt. Ugyanakkor 0,60 súlyrész Z-Nva-OH-t és 0,43 súlyrész HONBI-t oldunk 10 súlyrész dioxán-etilacetát (1: 1) elegyben, és hűtés 25 közben 0,5 súlyrészt DCC-t adunk hozzá. Az elegyet 2 órán át keverjük, majd a keletkezett DC-karbamidot leszűrjük és a kapott szűrletet szárazra pároljuk. A maradékot 2 súlyrész DMF-ben oldjuk és ehhez az oldathoz adjuk az előzőekben leírt amin-komponenst tartalmazó 30 DMF-oIdatot. A reakcióelegyet 10 órán át szobahőmérsékleten keverjük, az oldószert lepároljuk, a maradékot kloroformban oldjuk és 4%-os vizes nátriumhidrogénkarbonát-oldattaí és vízzel mossuk. A kloroformos fázist vízmentes magnéziumszulfát felett szárítjuk, majd 35 a kloroformot ledesztilláljuk. A maradékot éterrel triturálva por keletkezik, melyet szűréssel elválasztunk, és metanol-éter elegyből átoldjuk. Kitermelés 0,114 súlyrész termék. [OC]D = —56,2° (c = l, metanolban), Rf 1=0,37. 40 Elemzés a C26 H 40 O 7 N 8 képlet alapján: számított: C = 54,15, H =7,02, N = 19,43; talált: C =53,89, H=7,30, N = 19,21. 45 b) H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Nva-Arg-Pro-NHC2H 5 készítése 15 súlyrész ecetsavban 0,32 súlyrész Z-Nva-Arg(N02 )-Pro-NHC2 H 5 -öt oldunk. Az oldathoz 0,20 súlyrész palládiumkorom katalizátort adunk és 8 órán át hidro-50 génezzük. A katalizátort ezután szűréssel eltávolítjuk és az oldatot szárazra pároljuk. A maradékot 20 térfogatrész 2 n sósavban oldjuk és az oldatot liofilizálva sárgás port kapunk. A port 6 térfogatrész DMF-ben oldjuk, 0,38 súlyrész H-(Pyr)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-55 -OH-hidrokloriddal és 0,2 térfogatrész N-etil-morfolinnal együtt. Az elegyet 0 °C hőmérsékletre hűtjük, majd 0,12 súlyrész HONBI-t és 0,15 súlyrész DCC-t adunk. Az elegyet 0 °C-on 4 órán át, majd szobahőmérsékleten további 20 órán át keverjük. A keletkezett DC-karbami-60 dot szűréssel eltávolítjuk és a szűrletet szárazra pároljuk. A maradékot 10 súlyrész vízben oldjuk és Amberlite IRA-400 (acetát ciklus) oszlopon engedjük át, vízzel eluálva. Az átengedett oldatot és mosófolyadékokat egyesítve és liofilizálva a nyers peptidet kapjuk, melyet 65 karboximetilcellulózon végzett oszlopkromatográfiával 11
