168582. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szinezett szövetminták előállítására, hisztológiai célokra

168582 ismerik, ami növeli és meghosszabbítja a beteg és a család természetes nyugtalanságát. Mivel a nagyobb méretű minták, melyeken a diagnózis alapul, gyakran nem alkalmasak megőrzésre, munkaigényes kikészítést kell végezni annak érdekében, hogy az egészségi állapotot dokumentálják és egy hosszabb időre szóló hivatkozási alapot hozzanak létre. Néha előfordul, hogy a folyamat során bekövetkező szövetveszteség, mely ugyan kismértékű, éppen azt a szövetrészt érinti, amelyre az ideiglenes preparálás során a mikroszkópiai diagnózist alapozták. Saját korábbi bejelentésünkben leírtuk már egy új szövettani rögzítési módszert, melynél triklórecetsavat, cinkkloridot és formaldehidet tartalmazó, rövidszénláncú alkanol vizes oldatát alkalmazzuk. Ez a rögzítési mód károsítja legkevésbé a szövetminta sejtjeit és kényelmesen használható számos szövetfajtához. Arra a felismerésre jutottunk, hogy ez a rögzítő-oldat felhasználható egy, az eddigieknél jóval előnyösebb színezett szövetminták előállítására irányuló eljáráshoz is. A teljes színezés percek alatt elvégezhető és a kapott színezett minták hónapokig tárolhatók, speciális óvintézkedések nélkül. A találmány szerinti eljárás értelmében a színezendő szövetet gyorsan lehűtjük valamely ismert eljárással. A lehűtött szövetet felszeleteljük egy hagyományos mikrotómmal és a metszeteket olyan rögzítő oldatba merítjük, amely rövidszénláncú alkanol vizes oldatában levő triklórecetsavból, cinkkloridból és formaldehidből áll. A metszet már természetesen felenged a bemerítés közben és a rögzítés pillanatok alatt megtörténik. A bemerítés időtartama általában öt másodperc, és ennek meghosszabbítása előnnyel nem jár. A metszetet ezt követően vizes hematoxilin oldatba merítjük. A hematoxilin jól ismert színező oldat, kémiailag 7,11 b — dihidrobenz [b] indeno [1,2= d] pirán — 3, 4, 6a, 9, 10 (6H) — pentol. Ezt a lépést elvégezhetjük egy, vagy két lépcsőben. Az eljárás egyik foganatosítási módjánál a metszetet addig tartjuk a hematoxilin oldatban, amíg a színezés nem teljes, ami általában 10—30 másodpercet vesz igénybe. Egy másik foganatosítási mód szerint a mintát egy ideig hematoxilin oldatba merítjük be, kivesszük, vízzel leöblítjük, majd másodszor is bemerítjük hematoxilin oldatba. Ezen utóbbi megoldásnál a mintadarabot a második—hematoxilin oldatba való — bemerítése előtt rövid időre lítiumkarbonát-oldatba mártjuk be, mely gyorsítóként hat. így például a rögzítő oldatból kiemelt metszetet bemerítjük egy első hematoxilin oldatba kb. 15 másodpercre, majd vízbe mártva leöblítjük, rövid időre lítiumkarbonát oldatba merítjük, például 4 másodpercre, majd ismét hematoxilin oldatba merítjük 5 másodpercre. Ekkor a minta rögzítése már megtörtént és a sejtmag kékesbíbor színűre színeződött. Ezekután a minta a vizsgálatra mosással és szárítással előkészíthető; ez utóbbi művelet elvégezhető a hagyományos sorozatos bemerítéses módszerrel, ahol az oldatok a sorozatban növekvő mértékben hidrofób tulajdonságúak, ilyen pl. az etanol, abszolút etanol és xilol. Szükség esetén a minta ismert megkülönböztető színezési eljárással utószínezhető, pl. m-(3,6-dihidroxi-2,4,5,7-tetrabróm-xant-9-il)-benzoesav (eozin), (p-amino-fenil)-(p-amino-m-metil-fenil)-(p-imino-kinoil)-metán-hidroklorid (fukszin), pl. rozanilin, pararosaniline, magenta II, magenta III, vagy savas fukszin; pikrinsav, vagy hasonlók segítségével. Amint már említettük, a fixáló oldat triklórecetsavat, cinkkloridot, és formaldehidet tartalmazó rövid szén-5 láncú alkanol vizes oldata. A rövidszénláncú alkanol lehet bármely jól ismert, 1—4 szénatomos alkohol, mint pl. metanol, etanol, n-propanol, izopropanol, n-butanol és elágazó szénláncú butanolok. Ezek közül igen alkalmas gazdaságossági szempontból valamint az oldóhatá-10 sos erőssége szempontjából a metanol. A rövidszénláncú alkanol vizes oldatában az alkanol és a teljes vízmennyiség aránya 1: 1—1: 3 között változhat. Kedvező az 1:1, 1,1—1: 1,5 arányok közti tartomány. A vizes alkanol-oldatban van feloldva a triklórecetsav, a cink-15 klorid és a formaldehid. A cinkklorid és a triklórecetsav súlyaránya 2: 1—4 : 1 közötti. A 3 : 1 arány például teljesen megfelelő. A formaldehid és a triklórecetsav súlyaránya 8 : 1—10: 1 például 9 : 1 lehet. A rövidszénláncú alkanol vizes oldatában pl. 10 s%/ 20 /térfogat triklórecetsav, cinkklorid és formaldehid alkalmazása kedvező. A hematoxilin bármelyik szokásos formájában használható. Ilyen pl. a Harris' Hematoxilin, a Mayer's Haemalun, Erlich's Hematoxilin, a Lie által leírt alum 25 hematoxilin (Mayo Clinic Proceeding, 46 319) (1971. máj.) és a hasonlóak. Különösen előnyös hematoxilin, sárga higanyoxid és alumínium-ammóniumszulfát vizes glicerin oldatban való alkalmazása. Ezt a reagenst rendszerint alum hema-30 toxilin néven ismerik. A következőkben a találmány szerinti eljárásban alkalmazott oldatokat példák kapcsán közelebbről is szemléltetjük. 35 A) rögzítő oldat. 400 g cinkkloridot összekeverünk 120 g triklórecetsavval és 2,64 1 37%-os formaldehiddel, (ami megfelel 1055 g 100%-os formaldehidnek) 7,3 liter 95%-os metanolban (ami 7 liter 100%-os metanolnak felel meg) és 40 7 liter vízben. Ekkor enyhe hőfejlődéssel járó reakció játszódik le és miután az oldat szobahőmérsékletre hűlt le, megszűrjük és tartályokba töltjük. Ez a használatra kész oldat, mely bőr rögzítésére alkalmazható, megfelel egy 9,8 s%/térfogat triklórecetsav, cinkklorid és formal-45 dehid oldatnak, ahol a cinkklorid és a triklórecetsav aránya kb. 3.33 : 1 és a formaldehid, valamint a triklórecetsav súlyaránya kb. 9:1, olyan vizes metanol oldatban, ahol az alkanol és az összes víz térfogataránya (beleértve azt a vízmennyiséget is, amelyet a 95%-os 50 metanol és a 37%-os formaldehid tartalmaz) kb. 1:1,3. B) (1) Színező oldat. 33 ml vízmentes etanollal készített, 0,67 g hematoxi-Iint tartalmazó oldathoz 33 ml desztillált vizet, 33 ml 55 glicerint, 3,3 ml jégecetet és kálium-alumínium-szulfátot adunk. A keveréket jól összerázzuk és felhasználás előtt több hétig hagyjuk állni. B) (2) Színező oldat. 60 lg hematoxilint, 0,5 g sárga higanyoxidot és 12 g alumínium-ammónium-szulfátot keverünk 140 ml desztillált vízhez. A keveréket 10 percig forraljuk, lehűtjük, majd eredeti térfogatára kiegészítjük desztillált vízzel. Majd 60 ml glicerint és 8 ml jégecetet adunk hozzá és 65 a keveréket leszűrjük. 2