168530. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 5,7-vagy 6,7- diszubsztituált illetőleg 3,5,7-vagy 3,6,7-triszubsztituált pirazolo (1,5-a) pirimidinek előállítására
35 168530 36 Sor- R2 szám Hozam Op. C* Tapasztalati Elemző képlet zés 86. -NH-CH,-COOH 81 213-5 C12 H 16 N 4 0 3 C,H,N 87. -NH-CH2 -CH 2 -COOH 60 164-6 C13 H 18 N 4 03 C,H,N 63. példa A találmány szerinti előállított vegyületek foszfodieszteráz-gátló hatásának vizsgálata. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek foszfodieszteráz-gátló hatásosságát az alábbi módszerrel vizsgáltuk: 3 ',5 '-ciklusos-adenozinmonofoszfát-foszfodieszteráz (PDE) enzimet három különböző szövetből állítunk elő és tisztítunk a következő módon; nyúl-vese, nyúl-tüdő és marha-szív homogenizátumokat készíttetünk a szokásos módon, trisz-magnézium pufferoldattal (0,05 mól trisz-[-trisz-(hidroxi-metil)-aminometán] és 0,01 mól magnézium-acetát 1 liter vízben; ph: 7,4-re beállítva) majd az így kapott szövet-homogenizátumot a sejtmagok és a sejt-törmelékek eltávolítása céljából kis fordulatszámmal centrifugálunk. Az elkülönített szupernatáns folyadékot azután 30 percig centrifugáltuk 105 000 g-nak megfelelő fordulatszámmal és az így kapott szupernatáns folyadékot ammóniumszulfáttal frakcionálunk. A 0-30%-os telítettségnek megfelelő ammóniumszulfátkoncentrációnál képződött csapadékot centrifugálással, 20 000 g-nak megfelelő fordulatszámmal elkülönítettük, trisz-magnézium pufferoldatban oldottuk és ugyanilyen pufferoldattal szemben dializáltuk. Egy második ammóniumszulfátot frakciót készítettünk oly módon, hogy az első szuperaatáns-folyadékban a koncentrációt 50%-ra növeltük. Ezt a két ammóniumszulfátos frakciót, valamint a 30—50%-os koncentrációval kapott szupernatáns folyadékot PDE-aktivitásra vizsgáltuk, az Appleman [Biochem. 10,311 (1971)] átal leírt módszerrel. A kétféíevese-szövetből, valamint a tüdőszövetből kapott első frakciók oly PDE enzimet tartalmaznak, amely kis affinitást mutat 3',5'-ciklusos -adenozinmonofoszfáttal szemben (nagy Km-érték). A második frakció a Lineweaver-Burk analízis-módszer alkalmazása esetén kétfázisú görbét mutat. Ez arra mutat, hogy vagy két különböző enzim van jelen, amelyek egyikének nagy, másikának kis affinitása van 3',5',ciklusos adenozinmonofoszfáttal szemben, vagy pedig egy fehérje van jelen, két különálló reaktív hellyel. Appleman idézett munkájában utal arra, hogy az agyvelőkivonatból két különböző enzimnyerheto, amelyek egyike nagy, másika kis Km-értéket mutat, és amelyek gélszűrő-kromatográfiával elkülöníthetők egyástól, például a svéd Pharmacia Chemical Co. által gyártott „Sepharose-gel" gélszűrő alkalmazásával. Az alábbi I. és II. táblázatban összefoglalt inhibició-vizsgálati eredményeket nyúl-vese vagy nyúl-tüdő szövetből előállított kis affinitású enzimmel (I. frakció, nagy Km-értékkel) kaptuk. A ül. -VI. táblázat-18 15 ban ismertetett kísérleteket nyúl-tüdőből vagy nyúlveséből és marha-szívből kapott nagy affinitású enzimmel (n. frakció, kis Km-érték). A megadott I50- értékeket egyes esetekben a tartós I-értéknek az 1%-értékkel való aránybaállítása útján számítottuk, 20 szeles határok között változtatott inhibitor-koncentrációval, de állandó 3',5'-ciklusos-adenozinmonofoszfát- koncentrációval végzett kísérletek eredményeiből. Ez utóbbi koncentráció az I. és II. táblázatban ismertetett kísérletek esetében körülbelül 5.10—4 25 mól, a III. és IV. táblázatban ismertetett kísérletek esetében pedig 1,6.10—7 mól volt. Az egyes vegyületek viszonylagos inhibitor-aktivitását a teofillinnel való összehasonlítás alapján számított a-értékben fejeztük ki. Ezt az értéket oly módon kaptuk, hogy a 30 vizsgált vegyületre vonatkozólag megállapított Is0 -értéket elosztottuk a teofíllinre vonatkozólag kapott értékkel. A legtöbb esetben az a-értékeket egyetlen koncentrációval végzett inhibició-vizsgálat alapján számí-35 tottuk, mindaddig, míg a vizsgált vegyület e koncentrációjával kapott inhibició 20% és 80% között volt. Dyen esetekben tehát az a-értéket oly módon számítottuk ki, hogy az x% gátlást mutató teofillin-kon centrációt elosztottuk az ugyanilyen x% gátlást mu-40 tató vizsgált vegyület koncentárdójával. Ennek a módszernek a helyességét oly módon ellenőriztük, hogy összehasonlítottuk egymással egyrészt az inhibitor egyetien koncentrációjával végzett mérések során kapott a-értékeket, másrészt az inhibitor négy külön-45 böző koncentrációjával (az Is0 -értékek meghatározása során) kapott a-értékeket. Azt találtuk, hogy a kétféle módszerrel kapott a-értékek 10%-on belüli eltéréssel egyeznek egymással. Az inkubáció során alkalmazott elegy az alábbi 50 anyagokat tartalmazta (mikromólokban kifejezve). 3H-cÜdusos adenozinmonofoszfát (fajlagos aktivitás 2,180cmp/pmól) 0,00016 trisz pH = 7,5 40 55 magnéziumklorid 0,5 ciklusos-adenozinmonofoszfát-foszfodieszteráz enzim: 5—50 meg fehérje inhibitor 10— — 10—6 moláris koncentrációban. Az inkubációs idő 10 perc, 30 C° hőmérsékleten. 60 Az inkubáció befejeztével a kapott elegyet 2 percig melegítettük 90 C° hőmérsékleten, majd 100 meg kígyóméreg-foszfodieszterázt (Crotalus atrox kígyóból) adtunk hozzá és 10 percig inkubáltattuk tovább 30 C° hőmérsékleten. Ezután az elegyet lehűtöttük és 65 1 mm Dowex 1-2X (200-400 szitafínomsággal) szuszpenziót adtunk hozzá, amelyet oly módon állítottunk elő, hogy 100 g gyantát bekevertünk 200 g
