168486. lajstromszámú szabadalom • Eljárás coronavírus-szerű borjú-hasmenés-virus legyengítésére, valamint a legyengített vírust tartalmazó készítmény, főként vakcina előállítására

3 ' '168486 4 amelyeknél nem alkalmaztunk vakánás kezelést. Az általunk felsimert és elkülönített új, coronavírustípusú kórokozó vírust azért nevezzük csupán „coronavírus-szerű'; vírusnak, mert eddigi nem állt módunkban ellenőrizni az ismert coronavírusok valamennyi rendszertani kritériumát [vö.: AmJ.Vet. Res. c 33, 1155 (1972.); J.D. Almedia etc., Nature, 2__0_ 650 (1968); AmJ.Vet.Res._31j, 1915-Í928 (1970) J, de a kritériumok többségének azonosítása alapján bizonyossággal állítható, hogy coronavírus-szeru organizmusról van szó. 10 Ezt az így felismert új coronavírus-szerű kórokozót ezután tisztítási eljárásnak vetettük alá és részletesen megvizsgáltuk. Felismertük, hogy ez a coronavírusszerű vírus sejtkultúrákon szaporítható és e kultúrákból hatásos vakcina készíthető. Felismertük azt is, 15 hogy ilyen hatásos vakcinát oly módon állíthatunk elő, hogy a sejtkultúrán tenyésztett vírust a tenyésztés befejezése után inaktíváljuk. így tehát a találmány oly eljárás az említett új coronavírus-szerű kórokozó ellen hatásos vakcina előállítására, amelynek során a 20 vírust sejtkultúrákon tenyésztjük, majd inaktíváljuk. Az említett coronavírus-szerű vírus tisztítási módszereit és a vírus közelebbi leírását az Am J.Vet. Res. 33, 1147—1156 (1972) közleményekben ismertettük. Az említett coronavírus-szerű kórokozó tisztítását 25 az alábbi módon végeztük. Nebraska állam nyugati részében 19 különböző szarvasmarha-állományban a hasmenésben megbetegedett újszülött borjak székletéből vett mintákkal dolgoztunk. Az említett 19 állomány közül tizenkettő- 30 ben a borjakat előzetesen beoltottuk a borjak újszülöttkori hasmenéses megbetegedését okozó reovírusszerű kórokozó elleni vakcinával orális úton, míg a többi állományban vakcinás kezelést nem végeztünk. A hasmenéses borjak székletének mintájából vett 35 keneteket vagy imrnonfiuorescens szenei festettük meg a reovírus-szerű vírus kimutatása céljából [ezt a módszert az Univ. of. Nebraska, Agric. Exper. Sta. Res. Bull. 233 (1969) közleménye ismerteti] és csupán az említett reovírus-szerű vírusra negat^min- 40 iákat használtuk fel a további kísérletekben. A hasmenéses megbetegedéssel természetes úton fertőzött borjak hasmenéses székletéből vett mintákat azonnal megfagyasztottuk és a vírus-tisztítási munka megkezdéséig -20 °C és -60 °C közötti hőmérsékleten 45 tároltuk a munkákat. Desztillált és iontalanított vízzel különböző koncentrációjú szacharóz-oldatokat készítettünk, 8 ml térfogatú adagokban, 400, 300, 200 és 100 mg/ml szacharóz-tartalommal. Ezeket az oldatokat éjjelen át 50 állni hagytuk, 4°C hőmérséklete, majd 2,5 x 8,9 cm méretű cellulóz-nitrát centrifuga-edényekbe helyeztük őket. A vírus-tisztítási eljárás során valamennyi műveletet 4°C hőmérsékleten végeztünk; a centrifugálást egy 55 klinikai centrifugán és egy ismetrendszerű ultracentrifugán végeztük. A hasmenéses borjak székletéből vett anyagot háromszoros térfogatú iontalanított vízzel hígítottuk, majd 5000 g-nél 30 percig centrifugáltuk az így 60 hígított mintákat. A szupernatáns folyadékokat azután elkülönítettük és 3 óra hosszat centrifugáltuk őket percenként 25 000 fordulattal. Az így kapott szilárd anyagot azután szonifíkáció útján 30 másodpercig diszpergáltuk egy 5 súly/tf.%-os szacharóz-ol- 65 datban. Az így kapott szuszpenziót alkalmaztuk azután nyers vírus-szuszpenzióként. 2 5—5 ml fenti módon kapott nyers vírus-szuszpenziót adtunk a fent ismertetett gradiens szerinti szacharóz-oldatokat tartalmazó centrifuga-edényekbe és 2 óra hosszat centrifugáltuk percenként 25 000 fordulattal egy „SW 27" típusú rotorban. E centrifugálás után fényszórásinnódszerrel meghatároztuk a sávokat. Az egyes sávokból kapott anyagot egy propipettával felszerelt Pasteur-pipettával gyűjtöttük össze a centrifuga-edény felső rézéből. Az így kapott mintákat 1%-os ammónium-acetát-oldattal szemben dializáltuk, majd elektron-mikroszkopikus vizsgálatnak vetettük őket alá. A vírus-tartalmú frakciót (a meniszkusztól 6 cm-nyire levő sávból kapott, félig tisztított vírust) további tisztításnak vetettük alá, az említett koncentráció-grádiensó szacharóz-oldatokkal történő újabb centrifugálással, vagy pedig koncentráció-grádiensű cézium-klorid-oldatokkal lefolytatott centrifugálás útján. Az említett koncentráció-grádiensű szacharóz-oldatokkal történő további tisztítást a fentebb ismertetett tisztítási módszernek a kapott félig tisztított vírussal való megismétlése útján végeztük. Ezúttal is meghatároztuk a leírt módon a sávokat és a meniszkusztól 6,0 cm-re levő sávot elkülönítettük, majd 1%-os ammónium-acetát-oldattal szemben dializáltuk és így kaptuk a kívánt tisztított vírust. A félig-tisztított vírusnak a cézium-klorid-oldatokkal történő izopiknikus grádiens-centrifugálását oly módon végeztük, hogy egy 30%-os oldattal (15 g CsCl + 35 ml iontalanított víz) kezdtük meg a műveletet, ebből az oldatból 4 ml mennyiséget egy cellulóz-nitrát centrifuga-csőbe helyeztünk és több ily módon előkészített centrifuga-csőben 1,4 ml vírus-szuszpenziót rétegeztünk az említett oldat fölé. Ezután egy „SW 65" rotorban, percenként 60 000 fordulattal 18 óra hosszat centrifugáltuk a mintákat; ez idő alatt nyilvánvalóan elértük a centrifugált rendszerek egyensúlyát. A vírust tartalmazó zónában meghatároztuk a CsCl törésmutatóját egy „CS" refraktométerrel. A meniszkusztól 2,9 cm-re eső sávot elkülönítettük és 1%-os ammónium-acetát-oldattal szemben dializáltuk; ily módon a tisztított vírushoz jutottunk. A fentiekben említett nyers vírus-szuszpenzió 15 ml mintáit gél-szűréssel is frakcionáltuk, 4,2 x 42 cm méretű gél-oszlopon (Sepharose 2B, Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscatawy, N.J. cég gyártmánya) frakcionáltuk. Az oszlopot előzőleg 0,9%-os nátriumklorid-oldattal hoztuk egyensúlyba, majd ugyanilyen sóoldattal hívtuk elő a kromatogramot. Óránként 6,0 ml áramlási sebességgel dolgoztunk és 5 ml-es frakciókat fogtunk fel .Az egyes frakciók elnyelését 260 millimikronnál határoztuk meg spektrofotométer segítségével. A különböző csúcsértékeknek megfelelően kiválasztott anyagokat egyesítettük és ultra-szűréssel töményítettük. Alkalmaztunk egy egyszerűsített eljárást is a hasmenéses borjak széklet-anyagából nyert vírus kitermelésére. Ebben az esetben a széklet-anyagot közvetlenül centrifugáltuk 3400g-nál30 percig. A szupernatáns folyadék egy részét diklór-difluor-metánnal kétszer extraháltuk. 5 ml vizes fázist és 5 ml kezeié t'en szupernatáns folyadékot az előzőekben ismertetett szacharóz-koncentráció grádiensű oldatokkal végzett centrifugálásnak vetettünk alá. Az ilyen módon töményített vírust egyrészt elektronmikroszkópos vizsgálatok céljaira használtuk fél, másrészt pedig antigénként alkalmaztuk nyulak immun zálására, az immunofluorescens elemzés céljaira szolgáló készítmény előállítására. A körülbelül 6 hónapos