168486. lajstromszámú szabadalom • Eljárás coronavírus-szerű borjú-hasmenés-virus legyengítésére, valamint a legyengített vírust tartalmazó készítmény, főként vakcina előállítására

5 168486 6 fehér házinyulakat 14 ml vérnek a szívből történő vétele után, 4 különböző helyen, egyenként 0,25 ml térfogatú intramuszkuláros injekcióval kezeltük, 0,4 ml antigén-oldat és 0,6 ml Freund-féle teljes adjuváns elegyítése útján előállított oldattal. 5 héttel a beoltás után szív-funckió útján 70 ml vért vettünk a nyulaktól. Fluoreszceinnel jelzett gamma-globulint készítettünk a beoltás utáni szérumból, az ilyen célokra ismert módszerekkel (vö.: Proc. U.S. livestock San. Assn., 1968. okt., 139-144). A coronavírus-szerű kórokozónak a jelenlétét az előzőkben ismertetett módon, immunofluoreszcens •módszerrelkitudtuk mutatni a fertőzött bélben, a leírt módon elkészített konjugátummal. A konjugátumnak a coronavírus-szerű kórokozóval szembeni specifikusságát az alább ismertetett kísérletsorozat egyértelműen bizonyította: A hasmenéses, coronavírus-szerű kórokozóval fertőzött borjak bél-metszeteit megfestettük a konjugátummal; a bolyhos sejtek fluoreszcenciáját figyeltük meg e kísérlet során. A fentebb említett reovírusszerű kórokozó konjugétumával megfestett bél-metszetek nem mutattak fluoreszcenciát. A reo vírus-szerű vírussal megfertőzött hasmenéses borjak beléből vett metszetek viszont pozitív reakciót mutattak, ha a reovírus-szerű kórokozó konjugátumával festettük meg őket, míg a reakció negatív volt a coronavírus-szerű kórokozó konjugátumával történő megfestés esetén. A normális gnotobiotikus borjak beléből vett metszetek nem mutattak fluoreszcenciát, ha a coronavírusszerű kórokozó konjugátumával festettük meg őket. Az előzőkben ismertetett, koncentráció-grádienses ultracentrifugálási módszerrel tisztított vírustartalmú sávot elektronmikroszkópos úton is megvizsgáltuk. Egy előzetesen kollódiummai bevont és elgőzölögtetett, szénnel szilárdított, 200 mesh finomságú réz-szitára vittük fel az említett sávból kapott cseppeket. Ezeket a cseppeket — a vizsgálandó sáv fényszórásának mértékétől függően - 3-25 percig hagytuk az említett réz-szitán. A folyadék feleslegét azután szűrőpapírral felitattuk és vanadáto-molibdát-foszforvolframsav-oidat egy cseppjét vittük fel a szitára. Ezt 1-1,5 percig hagytuk ott, majd szűrőpapírral ismét felitattuk a folyadék feleslegét. Az így előkészített mintákat azután legalább 32 000-szeres nagyítású elektronmikroszkóppal vizsgáltuk. A méretmeghatározásokat a minták elektronmikrogramjainak és az e mikrogramok felvétele után közvetlenül, a műszer-beállítás megváltoztatása nélkül felvett párhuzamos diffrakciós mintáknak a dimenzionális elemzése útján végeztük. A teljes vírusrészecskék mérete az egyes mikrogramokon 107-160 millirnikron volt: a részecskék nem mutattak olyan felületi projekciót, amilyen a coronavírusok esetében megfigyelhető volt. A részecskéknek az elektron-mikroszkópiával meghatározott átlagos mérete 126 millirnikron volt. A nukleoxapszid polimorf jellegűnek mutatkozott, mérete változó volt és alakja is a kerektől a hosszúkásig változott. A 60 nukleoxapszidok burka különösen a rojtjaikat elvesztett nukleoxapszidoknál volt világosan látható. E rojtok szélessége változó, legfeljebb 23 millirnikron volt. A jól tartósított részecskék felületi projekciói szirom-alakúak voltak, vékony szárakkal kapcsolód- 65 tak a részecskékhez; átlagos hosszúságuk 11 mfllimikron volt. Az itt leírt coronavírus-szerű kórokozók a fentebb ismertetett morfológiai tulajdonságaik és méretük alapján könnyen megkülönböztethetők azoktól az egyéb vírusoktól, amelyek az újszülött borjak hasmenéses megbetegedésében kórokozókként eddig 5 szerepeltek. Az itt leírt coronavírus-szerű kórokozó morfológiai tulajdonságai eltérőek az enterovírusok, a borjú-pneumonia- enteritis vírusok, a vírusos szarvasmarha-hasmenés vírus, a reovírus-szerű újszülöttkori borjú-hasmenés vírus és a Hayden-víruS mor-10 fológiai tulajdonságaitól és méretük is nagyobb ez utóbbiakénál. Az általunk felismert új vírus továbbá kisebb méretű, mint a fertőző szarvasmarha-rhinotracheitis vírusé és jellemző morfológiai tulajdonságai is eltérnek ezekétől. A tisztított coronavírus-szerű vírus 15 úsztatási módszerrel mértsűrűsége-(CsCl-oldat alkalmazásával) 1,24, míg a reovírus-szerű vírus esetében ,ez a sűrűség 1,359(vö.:Can.J.Comp.Med., 1971.35). A coronavírus-szerű vírus fiziológiai hatásai is eltér-20 nek a reovírus-szerű víruséitól. A gnotobiotikus borjaknak a reovírus-szerű vírussal orális úton történő beoltása után az inkubációs időszak rövid, 13,5—14 óra, míg a coronavírus-szerű vírus esetében a tapasztalt legrövidebb inkubációs időszak is legalább 18 óra 25 volt. Emellett a reovírus-szerű vírussal fertőzött gnotobiotikus borjak 5—8 óra hosszat szenvednek a hasmenésben, majd a hasmenés fellépése után 24 órával már normálisaknak mutatkoznak. Ezzel szemben a coronavírus-szerű kórokozóval fertőzött gnoto-30 biotikus borjaknál a hasmenés legalább 5 napig tart és a borjak gyakran elhullanak 2-3 nappal a hasmenés fellépése után. Az általunk felismert és a fenti módon jellemzett 35 coronavírus-szerű vírus által okozott borjú-hasmenés ellen hatásos védelmet nyújtó vakcina előállítása céljaira a vírust legyengített, már nem kórokozó aktivitású, de a fertőzés ellen immunitást nyújtó állapotba kell hozni. Ezt a célt oldja meg a találmány, 40 amelynek tárgya eljárás a coronavírus-szerű borjú-hasmenés-vírus legyengítésére. Az újszülöttkori, coronavírusos fertőzés által okozott hasmenésben megbetegedett borjakból vagy azok ürülékéből vett vírustartalmú anyagból borjú-vesesejt-kultúrán kitenyésztett 45 vírust a találmány értelmében borjú-vesesejt-kultúrán - amelyet célszerűen magzati állapotú borjak veséjéből készítünk — 5—60 passzázson visszük át, előnyösen 30—40 °C hőmérsékleten történő inkubációval. Az eljárás egyik előnyös kiviteli alakja esetében 50 összesen 10-40 passzázst folytatunk le, mimellett .ezek közül 5—10 passzázst primer vagy szekunder magzati borjúvese-sejtkultúrán, a további passzázsokat pedig már előzetesen több passzázson átvitt magzati borjúvese-sejtkultúrán végezzük. >5 A találmány körébe tartozik - a fenti eljárás továbbfejlesztéseként - a fenti módon legyengített * vírust hatóanyagként tartalmazó, az újszülött borjak hasmenéses megbetegedésének megelőzésére és/vagy gyógykezelésére alkalmas készítmény, főként vakcina előállítása is. Az ilyen készítményekhez a legyengített víruson kívül valamely inaktíválószert, célszerűen formaldehidet, a vakcinakészítésben szokásos segédanyagokat és kívánt esetben egyéb immunizáló anyagokat, például a reovírus-szerű borjú-hasmenés-vírus ellen védő készítményt (vö.: 1 276 218 sz. nagy-britanniai szabadalmi leírás) is adhatunk. 13